Primjena ultrafiltracije u ekstrakciji prirodnog kolagena

Kolagen, kao prirodni proteinski izvor, ima dobru biokompatibilnost, nisku antigenost, biorazgradljivost i hemostazu, čvrstu spiralnu strukturu i vlastita svojstva, što sve daje preduvjete za njegovu industrijalizaciju. Kolagen i njegovi nusproizvodi ne koriste se samo kao materijali za pakiranje, kozmetički i zdravstveni proizvodi, već i kao dodaci hrani za poboljšanje mesnih proizvoda, a igra važnu ulogu, posebno u medicinskom polju.

 

Što je kolagen?

 

Kolagen je biološka makromolekula, glavna komponenta životinjskog vezivnog tkiva, te najzastupljeniji i najrasprostranjeniji funkcionalni protein kod sisavaca, koji čini 25% do 30% ukupnih proteina, au nekim organizmima i do 80% i više. Ima ulogu vezivnog tkiva u životinjskim stanicama.

Izmjereno je da tijelo odrasle osobe ima oko 3 kg kolagena, koji uglavnom postoji u ljudskoj koži, kostima, očima, zubima, tetivama, unutarnjim organima (uključujući srce, želudac, crijeva, krvne žile) i drugim dijelovima ljudskog tijela, a njegov funkcija je održavanje morfologije i strukture kože i tkiva i organa, a također je važna sirovina za popravak različitih tkiva nakon ozljeda.

 

Postoji mnogo vrsta proteina kolagena, a uobičajeni tipovi su tip I, tip II, tip III, tip V i XI. Zbog svoje dobre biokompatibilnosti, biorazgradivosti i bioaktivnosti, kolagen se naširoko koristi u hrani, medicini, inženjerstvu tkiva, kozmetici i drugim područjima.

Kako izvući prirodni kolagen

Životinjska tkiva stoke i peradi glavni su način na koji ljudi dobivaju prirodni kolagen i njegove kolagenske peptide. Međutim, zbog povezanih bolesti životinja i određenih vjerskih uvjerenja, ljudska uporaba kolagena i njegovih proizvoda od kopnenih sisavaca je ograničena, a razvoj se postupno okreće morskim organizmima. Europska agencija za sigurnost hrane (EFSA) potvrdila je da čak ni kolagen dobiven iz životinjskih kostiju nema potencijal zaraziti kravlje ludilo i druge srodne bolesti. Zbog razlika u sastavu aminokiselina i stupnju umrežavanja, vodene životinje, posebno kolagen bogat otpadom od njihove obrade kao što su koža, kosti i ljuska, imaju mnoge prednosti koje nema kolagen stoke. Osim toga, kolagen dobiven iz morskih životinja očito je bolji od kolagena kopnenih životinja u nekim aspektima, poput niske antigenosti i hipoalergenosti. Stoga vodeni kolagen može postupno zamijeniti kolagen kopnenih životinja. Kao primjer je uzet proces ekstrakcije kolagena iz ribljih ljuskica amura.

 

Ekstrakcija kolagena iz ribljih ljuskica amura metodom ultrafiltracije

1. Materijali i metode

1.1 Ispitni uzorak

Vodeni ekstrakt sirovog kolagena.

1.2 Metode ispitivanja

1.2.1 Proces ultrafiltracije

 

1.2.2 Određivanje postupka predfiltracije

U ovom testu, metoda vakuumske filtracije i metoda mikrofiltracije uspoređuju se i analiziraju kako bi se odredio najbolji postupak filtracije prije filtracije. Specifične ispitne metode su sljedeće:

① Sirovi vodeni ekstrakt kolagena filtriran je vakuumskim pumpanjem filter papira kako bi se uklonile suspendirane čestice i nečistoće u vodenom ekstraktu.

② Vodeni ekstrakt sirovog kolagena filtriran je 0.2μm mikrofiltracijskom membranom kako bi se uklonile netopljive tvari i nečistoće u vodenom ekstraktu.

 

1.2.3 Odabir veličine pora ultrafiltracijske membrane

Veličina pora ultrafiltracijske membrane bila je 100 kDa.

 

1.2.4 Eksperiment s jednim faktorom procesa ultrafiltracijskog pročišćavanja

Tehnologija ultrafiltracije korištena je za pročišćavanje sirovog vodenog ekstrakta kolagena, a proučavani su jednofaktorski eksperimenti o učincima radnog tlaka, radne temperature i pH vrijednosti na retenciju kolagena. Nakon što je oprema za ultrafiltraciju pokrenuta neko vrijeme i stabilizirana, proučavan je utjecaj različitih čimbenika na retenciju kolagena.

 

1.2.5 Formula za izračun

 

2. Rezultati i analiza

2.1 Rezultati analize procesa predfiltracije

Rezultati usporedbe dviju metoda filtracije vakuum ekstrakcije i mikrofiltracije prikazani su u sljedećoj tablici.

 

Iz tablice se može vidjeti da i metoda vakuumske filtracije i metoda mikrofiltracije mogu ukloniti nečistoće i netopljive krutine u otopini, ali metoda mikrofiltracije ima bolji zaštitni učinak na proteine, odnosno gubitak nije očit, a metoda vakuumske filtracije je lako uzrokovati gubitak proteina. Osim toga, metoda vakuumske filtracije čini zamućenje nakon što se filtrat stavi na određeno vrijeme, a mikrofiltrat je još uvijek bistar i proziran, tako da je mikrofiltracija odabrana kao postupak predtretmana ultrafiltracije.

 

2.2 Jednofaktorsko ispitivanje procesa ultrafiltracije

2.2.1 Utjecaj tlaka ultrafiltracije na brzinu zadržavanja

U uvjetima temperature od 40 stupnja i pH=9.0, utjecaj različitih tlakova ultrafiltracije (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa i 0,15MPa) proučavano je zadržavanje proteina. Rezultati su prikazani na slici ispod.

Kao što se može vidjeti na gornjoj slici, s povećanjem radnog tlaka, stopa zadržavanja proteina postupno se smanjuje. Kada je radni tlak {{0}}.07MPa, stopa zadržavanja proteina je 96,53%, a kada je radni tlak 0,15MPa, stopa zadržavanja proteina je 84,38%. To je zato što se učinak razdvajanja ultrafiltracije na tvari provodi razlikom tlaka. U području niskog radnog tlaka, male molekule mogu brzo proći kroz membranu, dok velike molekule mogu biti zarobljene ultrafiltracijskom membranom i nakupljene na površini membrane. U to vrijeme površina membrane i vodeni ekstrakt tvore razliku koncentracije, što rezultira otporom polarizacije koncentracije. U ovom trenutku, pritisak je relativno nizak i ne može imati veliki utjecaj na stopu zadržavanja. Međutim, s povećanjem tlaka, koncentracijski polarizacijski otpor postupno raste, a koncentracijska razlika između površine membrane i vodenog ekstrakta postiže ravnotežu. Kada tlak prijeđe ovu ravnotežu, na površini membrane može se formirati sloj gela (što je u skladu s teorijom da se koncentracijska polarizacija i kondenzacijski sloj stvaraju tijekom ultrafiltracije), a tlak nastavlja rasti, povećava se debljina sloja gela. , a povećava se i količina proteina koji ostaju na površini membrane. To rezultira nižom stopom zadržavanja. Kako bi se osigurao učinak razdvajanja membrane, optimalni parametar radnog tlaka je 0,07MPa.

 

2.2.2 Utjecaj temperature na retenciju proteina

Pod uvjetima od {{0}}.11MPa tlaka i pH=9.0, učinci različitih temperatura, naime 25 stupnjeva, 30 stupnjeva, 35 stupnjeva, 40 stupnjeva i 45 stupnjeva, na proteine proučavano je zadržavanje. Rezultati su prikazani na slici ispod.

Kao što se može vidjeti na gornjoj slici, stopa zadržavanja ultrafiltracijske membrane postupno raste s porastom temperature i doseže maksimum na 45 stupnjeva, sa stopom zadržavanja od 97,01%. To je zato što je viskoznost kolagena usko povezana s temperaturom. Kada je temperatura niska, viskoznost kolagena je veća, a nakupljanje kolagena na površini membrane lako stvara otpor, što rezultira niskom stopom zadržavanja. Kada se temperatura poveća, viskoznost kolagena se smanjuje, međudjelovanje između molekula kolagena je oslabljeno, a brzina prijenosa mase se povećava, fenomen koncentracijske polarizacije je oslabljen, a stopa zadržavanja raste. Drugi razlog za povećanje stope zadržavanja je taj što se temperatura povećava, topivost kolagena se također povećava odgovarajuće, a pojava kolagena koji blokira membranu je smanjena, tako da je optimalna temperatura ultrafiltracije 45 stupnjeva.

 

2.2.3 Utjecaj pH vrijednosti na retenciju proteina

Pod uvjetima od {{0}}.11MPa tlaka i temperature od 40 stupnjeva, utjecaj različitih pH uvjeta, naime pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 i pH=10.0, na stopu zadržavanja je proučavano. Rezultati su prikazani na slici ispod.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, stopa zadržavanja postupno raste s porastom pH vrijednosti. To je zato što je ultrafiltracijska membrana polieter javorova membrana s negativnim nabojem, a kolagen je negativno nabijen u alkalnim uvjetima. Negativno nabijene molekule kolagena tvore međusobno isključivo stanje s ultrafiltracijskom membranom s istim nabojem, stoga je molekulama kolagena teško ostati na površini membrane i blokirati membranu. Stoga je optimalna pH vrijednost ultrafiltracije 8-10.

 

2.3 Optimizacija procesa ultrafiltracije i verifikacija rezultata

Prema analizi softvera Design-Expert8.05, optimalni procesni parametri su: radni tlak 0.14MPa, radna temperatura 40.98 stupnjeva, pH otopine{{7 }}.43, a stopa zadržavanja je 92,551%. S obzirom na operativnost stvarnih parametara, odabrani su uvjeti ultrafiltracije kao radni tlak od 0,14 MPa, radna temperatura od 40 stupnjeva i pH vrijednost otopine materijala od 9,50, a provjera ispitivanja započela je nakon pokretanja i stabilizacije sustava ultrafiltracije. Rezultat stope zadržavanja bio je (92,61±0,1) % (n=3). Predviđene vrijednosti jednadžbe u osnovi su slične izmjerenim vrijednostima, što pokazuje da su predviđeni rezultati parametara stanja u skladu sa stvarnim rezultatima stanja.

 

2.4 Rezultati elektroforetske analize

Pročišćeni kolagen je analiziran SDS-PAGE elektroforezom, a rezultati su prikazani na sljedećoj slici.

 

Kao što se može vidjeti na gornjoj slici, linija 1 je pročišćeni kolagen ovog testa, a linija 2 je standardni uzorak kolagena tetive potkoljenice. Iz SDS-PAGE elektroforeze može se vidjeti da se kolagen u ovoj studiji može identificirati kao kolagen, ali čini se da granice između a1 peptidnog lanca i a2 peptidnog lanca nisu jasne. Iz elektroforetske karte je vidljivo da nema drugih proteinskih nečistoća, pa se može zaključiti da je pročišćeni kolagen visoke čistoće.

O Guidlingu

 

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko poduzeće koje se fokusira na biofarmaceutike, kulturu stanica, pročišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnozu i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filtarske uređaje, kazete za ultrafiltraciju i mikrofiltraciju, filtar za viruse, TFF sustav, dubinski filtar, šuplja vlakna itd. koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutike, stanične kulture itd. Naše membrane i membranski filtri naširoko se koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do proizvodnih filtracijskih sustava, ispitivanja sterilnosti, fermentacije, kulture stanica i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology veseli se suradnji s vama!