Mjere opreza za uporabu ultrafiltracione cijevi
(1) Odaberite odgovarajuću ultrafiltracijsku cijev. Općenito, molekularna težina koju treba zadržati ne smije biti veća od 1/3 molekulske težine ciljnog proteina. Na primjer, ako je molekularna težina ciljnog proteina 35 kDa, može se odabrati ultrafiltracijska cijev s molekulskom težinom od 10 kDa. Ako je molekularna težina ciljnog proteina oko 10 kd, može se koristiti ultrafiltracijska cijev s molekulskom težinom od 3KD. Pažljivo pročitajte upute za uporabu i obratite pozornost na različitu toleranciju ultrafiltracijske membrane na različite kemikalije.
(2) Novokupljena ultrafiltracija je suha. Prije upotrebe dodajte ultračistu vodu i voda će u potpunosti proći kroz membranu. Prethodno ga ohladite u ledenoj kupelji ili u hladnjaku nekoliko minuta. Zatim izlijte vodu i dodajte otopinu proteina. Dodana količina ne smije prelaziti bijelu crtu na vrhu epruvete. Operacija bi trebala biti lagana. Prije dodavanja proteinske otopine, ultrafiltracijsku cijev potrebno je umetnuti na led radi prethodnog hlađenja.
(3) Ravnoteža. I masa i težište trebaju biti uravnoteženi. Imajte na umu da brzina i ubrzanje ne smiju biti prebrzi, inače će se ultrafiltracijska membrana izravno oštetiti. Započnite centrifugalnu ultrafiltraciju (predhlađenje centrifuge na 4 stupnja). Nakon što se broj okretaja različitih centrifuga pretvori u G, on je drugačiji. Podesite ubrzanje centrifuge na najniži stupanj prijenosa kako biste smanjili pritisak na membranu. Imajte na umu da morate pričekati dok centrifuga ne postigne ciljnu brzinu prije nego što napustite centrifugu, inače kada dođe do problema s centrifugom, ne možete se nositi s njim u prvi put. Smjer membrane i rotirajuće osovine se podešavaju prema uputama (u slučaju kutne rotirajuće centrifuge, membrana je okomita na osovinu). U praktičnoj upotrebi, brzina je općenito niža od one u priručniku, što može produžiti vijek trajanja centrifugalne cijevi.
(4) Kada se koncentrira do preostalih 1 ml, uzmite 50 ul otopine pufera i dodajte 10 ul da protječe kako biste vidjeli hoće li postati plavo, kako bi se procijenilo da li ultrafiltracijska cijev propušta protein. Ako cijev propušta, ulijte gornji sloj i protočite kroz novu cijev i počnite s ultrafiltracijom. Da biste točno procijenili curi li epruveta, centrifugirajte s 5mgml BSA 10 minuta, zatim procijedite, provucite proteinsko ljepilo ili Bradford za grubo mjerenje i nastavite dodavati preostalu otopinu proteina za koncentraciju (operirajte na ledu kako biste spriječili da se protein grije) dok se ne dodaju sve koncentrirane otopine. Obratite pažnju na to dolazi li do taloženja proteina tijekom centrifugiranja, što rezultira začepljenjem cijevi. Ako dođe do precipitacije, utvrdite specifičan uzrok precipitacije, je li koncentracija proteina previsoka ili je pufer neprikladan; Prvi se može riješiti istovremenom ultrafiltracijom s više ultrafiltracijskih cijevi kako bi se smanjila koncentracija. Potonje je mijenjanje različitih puferskih otopina dok se protein ne istaloži.
(5) Prethodni koraci se koriste za koncentriranje proteina. Ako želite promijeniti pufer, kada se ukupna otopina proteina koncentrira na oko 1 ml, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracija kroz 0.22um ultrafiltracijsku membranu), a zatim koncentrirajte na oko 1 ml tri uzastopna puta. Konačni volumen posljednje koncentracije ovisi o potrebnoj koncentraciji proteina, koja općenito nije veća od 500ul, ili se može koncentrirati na manje od 200ul. Prema volumnoj koncentraciji od najmanje 10 puta svaki put, može doći do više od 1000 puta tri puta, čime se u osnovi može postići svrha promjene pufera.
