Kako odabrati odgovarajuću cijev za ultrafiltraciju
Ultrafiltracijske cijevi koje se obično koriste za koncentraciju proteina i zamjenu pufera često se koriste u epruvetama za ultrafiltraciju. Postoje i drugi modeli, koji imaju različite veličine volumena i ultrafiltracijske cijevi, ovisno o molekularnoj težini ciljanog proteina, volumenu prije koncentracije i ciljnom volumenu koncentracije. Za višekratnu upotrebu.
1. Odaberite prikladnu cijev za ultrafiltraciju, uglavnom uzimajući u obzir MWCO i volumen koncentracije. Općenito, molekularna težina ne smije biti veća od 1/3 molekulske težine ciljnog proteina. Ako je molekularna težina ciljnog proteina oko 10 kd, može se koristiti ultrafiltracijska cijev sa zadržanom molekulskom težinom od 3 KD.
2. Novokupljena ultrafiltracija je suha. Prije upotrebe dodajte milliq vode. Voda u potpunosti prolazi kroz membranu i prethodno se hladi u ledenoj kupelji ili u hladnjaku nekoliko minuta. Zatim izlijte vodu da dodate otopinu proteina. Količina proteinske otopine ne smije prelaziti bijelu crtu na vrhu epruvete. Jednostavan rad. Prije dodavanja proteinske otopine, ultrafiltracijsku cijev potrebno je umetnuti u led radi prethodnog hlađenja.
3. Ravnoteža. Masa i težište moraju biti uravnoteženi. Imajte na umu da brzina i ubrzanje ne smiju biti prebrzi, inače će se ultrafiltracijska membrana izravno oštetiti. Pokrenite centrifugalnu ultrafiltraciju (prethodno hlađenje centrifuge na 4 stupnja). Smjer membrane i rotirajuće osovine mogu se podesiti prema uputama (u slučaju kutne centrifuge, dijafragma je okomita na osovinu). U stvarnoj uporabi, opća brzina je niža od one navedene u priručniku, što može produžiti vijek trajanja centrifugalne cijevi.
4. kada se koncentrira do preostalih 1 ml, [uzmite 50 ul otopine Bradforda za domaćinstvo, dodajte 10 ul tekućine da vidite da li postaje plava i odredite da li ultrafiltracijska cijev propušta protein. Ako cijev procuri, ulijte je u gornji sloj i zatim se vratite u novu cijev kako biste započeli ultrafiltraciju. Da biste točno odredili curi li epruveta, 5 mg 10 min centrifugirajte 10 min, zatim prođite kroz nju, prođite proteinski gel ili Bradford] [grubo mjerenje]. Nastavite dodavati preostalu otopinu proteina u koncentriranje (radite na ledu kako biste spriječili zagrijavanje proteina) sve dok se ne dodaju sve koncentrirane otopine. Tijekom centrifugiranja obratite pozornost na to dolazi li do taloženja proteina i uzrokuje li začepljenje cijevi. Ako dođe do precipitacije, molimo utvrdite specifičan uzrok taloženja, je li koncentracija proteina previsoka ili je pufer neprikladan; Prvi se može riješiti korištenjem više ultrafiltracijskih epruveta u isto vrijeme kako bi se smanjila koncentracija, dok potonji mogu mijenjati različite pufere dok se protein ne istaloži.
5. Prethodni koraci se koriste za koncentriranje proteina. Ako se pufer treba zamijeniti, kada se ukupna otopina proteina koncentrira na oko 1 ml, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracija kroz 0.22um ultrafiltracijsku membranu), a zatim kontinuirano koncentrirajte do oko 1 ml tri puta, tako da da konačna koncentracija ovisi o potrebnoj koncentraciji proteina, koja obično nije veća od 500ul ili manja od 200ul. Prema volumnoj koncentraciji od najmanje 10 puta svaki put, to je više od 1000 puta više od tri puta, što u osnovi može postići svrhu promjene pufera.
6. Uklonite konačni proteinski koncentrat. Operite na ledu. Koristeći žuti vrh pipete (200ul), nježno umetnite vrh pipete uz rub, zatim lagano puhnite i pomiješajte proteinsku otopinu. Pazite da ne dodirnete ultrafiltracijsku membranu. Svaki put usisati koncentriranu otopinu do 200ul dok se potpuno ne usisava. Nije potrebno ekstrahirati posljednju koncentriranu otopinu na dnu epruvete, inače je preteško i može doći do oštećenja ultrafiltracione membrane. Konačno, milliq voda se dodaje u cijev za ultrafiltraciju bez prolaska kroz ultrafiltracijsku membranu kako bi se spriječio gubitak vode i sušenje membrane.
7. Sljedeći su koraci za obradu ultrafiltracijske cijevi i ponovnu upotrebu cijevi za ultrafiltraciju.
8. Ulijte vodu u cijev za ultrafiltraciju i nježno isperite milliq vodom nekoliko puta. [ako je očito taloženje proteina na dnu epruvete, možete prvo dodati vodu, a zatim ispuhati pipetom. Pazite da ne dodirnete membranu. Talog visi i onda bježi. Ne možete ga isprati vodom iz slavine. Nakon dodavanja 0.2 m otopine NaOH, stavite je na sobnu temperaturu na 20 minuta i uravnotežite cijev za ultrafiltraciju tijekom tog razdoblja. Centrifugirajte još 10 minuta. Izlijte preostalu otopinu NaOH i uronite pamučnu jezgru u čašu (1 ili 2L) Milliq vode, stavljenu na nekoliko sati, a zatim zamijenjenu novom vodom, stavljenu na nekoliko sati da se kontinuirano razrijedi koncentracija NaOH. Operite epruvetu od 50 ml i pokrijte vodom iz slavine, a unutarnju stijenku operite milliq vodom.
9. Izvadite jezgru uronjene epruvete, dodajte je punoj milliq vodi, a zatim napunite epruvetu od 50 ml milliq vodom. Polako stavite jezgru tube u 50 ml.
Centrifugirajte cijev, ocijedite i razdijelite vodu, zatim poklopite i čuvajte na 4 stupnja do sljedeće upotrebe. Općenito govoreći, prema gore navedenim koracima i mjerama opreza, svaka cijev se neće slomiti u roku od tri ili četiri godine.