Potpuna analiza procesa proizvodnje lijekova MRNA: Kako TFF tehnologija rješava izazove pročišćavanja
Posljednjih je godina mRNA tehnologija postigla značajan napredak u biofarmaceutskom području, pokazujući ogroman potencijal primjene, posebice u cjepivima i genskoj terapiji. Uspješan razvoj mRNA cjepiva nije samo pružio nova rješenja za prevenciju i kontrolu zaraznih bolesti, već je također potaknuo napredak u imunoterapiji raka i personaliziranoj medicini. Kao nova klasa terapeutskih proizvoda, proizvodnja mRNA u velikim-razmjerima vrlo je izazovna, uključujući kontrolu stabilnosti RNA, uklanjanje zaostalih enzima i reakcijskih nus-proizvoda, izmjenu pufera i postizanje visokih-stopa oporavka čistoće, a sve to zahtijeva proizvodne tehnologije s regulatorno-odobrenim rješenjima.
Proces proizvodnje mRNA cjepiva ili terapeutika uglavnom je podijeljen u tri faze: priprema otopine plazmidne DNA, priprema otopine mRNA i priprema proizvoda lijeka mRNA-LNP.
Dijagram toka procesa proizvodnje lijeka mRNA
Filtracija tangencijalnog protoka (TFF), kao-etablirana tehnologija odvajanja membrane, naširoko se primjenjuje u proizvodnji mRNA zbog svoje visoko{1}}učinkovite sposobnosti molekularnog prosijavanja, kontrolirane izmjene pufera i karakteristika niskog smičnog naprezanja. Na temelju dizajna membranskog modula, uobičajene konfiguracije TFF-a uključuju ravne-kazete s limom i module sa -šupljim vlaknima. Osim toga, membransko odvajanje -potaknuto tlakom u TFF-u može se klasificirati u mikrofiltraciju (MF), ultrafiltraciju (UF), nanofiltraciju (NF) i reverznu osmozu (RO) prema veličini pora membrane, s postupno rastućom selektivnošću.
TFF igra ključnu ulogu u višestrukim fazama proizvodnje mRNA lijekova, uključujući pripremu mase plazmidne DNA, masovnu proizvodnju mRNA i konačnu formulaciju mRNA-LNP proizvoda lijekova. Odgovarajućim odabirom tipa membrane, molekularne težine cut-(MWCO) i materijala membrane, TFF omogućuje učinkovito uklanjanje nus-proizvoda reakcije i nečistoća niske-molekularne-težine, dok također olakšava izmjenu pufera i koncentraciju prije i nakon LNP kapsulacije. Ovo značajno poboljšava čistoću RNK, stabilnost i sveukupnu skalabilnost procesa.
Osim toga, na izvedbu filtracije tangencijalnog protoka utječu čimbenici konfiguracije sustava kao što su tip pumpe i dizajn cijevi, kao i ključni procesni parametri uključujući transmembranski tlak (TMP), smično naprezanje i filtracijski tok. Ti čimbenici moraju biti pažljivo odabrani i optimizirani na temelju karakteristika ciljanog proizvoda, posebno za-proizvode osjetljive na stres kao što je mRNA–LNP, koji su vrlo osjetljivi na vanjske mehaničke sile tijekom obrade.
Pročišćavanje plazmidne DNA
Priprema matične otopine plazmidne DNA temeljno se temelji na dizajnu sekvence transkripcijske šablone. Metode pripreme obično uključuju umnožavanje plazmidne DNA, iako se također može koristiti PCR umnožavanje. Uzimajući DNK pojačanje kao primjer, projektiranoE. coliobično se koristi za pojačavanje-temeljeno fermentacijom. Nizvodni proces pročišćavanja uglavnom uključuje prikupljanje stanica, lizu i bistrenje, koncentraciju i izmjenu pufera, sterilnu filtraciju, linearizaciju i kromatografsko pročišćavanje. U industrijskim uvjetima, kontinuirano{3}}centrifugiranje protoka često se koristi za prikupljanje stanica, ali stvara relativno velike sile smicanja. Sustavi šupljih vlakana, sa svojim otvorenim kanalima i niskim smicanjem, prikladniji su za rukovanje uzorcima s visokim sadržajem krutine, visokom viskoznošću ili osjetljivošću na smicanje, kao što je plazmidna DNA. Nakon prikupljanja, stanice se podvrgavaju visokotlačnoj-homogenizaciji, ultrazvučnoj obradi ili alkalnoj lizi, nakon čega slijedi preliminarno bistrenje dubinskom filtracijom.
Kako bi se olakšala naknadna kromatografija, filtracija tangencijalnog protoka (TFF) koja koristi membranske kazete ili kolone sa šupljim vlaknima s prekidima molekularne težine od 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa često se prvo koristi za koncentraciju i izmjenu pufera. Time se smanjuje volumen uzorka dok se istovremeno uklanjaju neke nečistoće kao što su RNK, proteini stanica domaćina (HCP) i fragmenti DNK stanice domaćina (HCD). Kromatografija služi kao korak pročišćavanja jezgre. Tipično, kromatografija anionske izmjene (AEX) kombinira se s kromatografijom hidrofobne interakcije (HIC) za učinkovito uklanjanje nečistoća i obogaćivanje visoko bioaktivne supersmotane plazmidne DNA, čime se značajno poboljšava čistoća plazmida.
Nakon pročišćavanja, plazmid se ponovno podvrgava TFF-u kako bi se otopina koncentrirala na ciljnu koncentraciju (obično 0,5-2 mg/mL) i kako bi se provela dijaliza s puferom za konačno skladištenje. Ovaj korak uklanja zaostale soli i organska otapala iz procesa, osiguravajući da puferski sustav ispunjava zahtjeve za reakcije in vitro transkripcije (IVT) nizvodno.
Pročišćavanje in vitro transkribirane (IVT) mRNA
In vitro transkripcija (IVT) i modifikacija ključni su procesi za pripremu matičnih otopina mRNA. Tijekom proizvodnje mRNA IVT koristi se kombinacija filtracije tangencijalnog protoka (TFF1) – kromatografije – filtracije tangencijalnog protoka (TFF2). Ova strategija osigurava učinkovito i visoko{4}}kvalitetno pročišćavanje mRNA, pružajući ključnu podršku za proizvodnju cjepiva.
Nakon što su reakcije transkripcije i modifikacije dovršene, obično se prvo provodi ultrafiltracija/dijafiltracija pomoću membranskih kazeta ili kolona sa šupljim vlaknima s prekidima molekularne težine od 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa. Ovaj korak učinkovito uklanja razne nečistoće-povezane s procesom iz reakcijskog sustava, kao što su RNA polimeraza, zaostali fragmenti DNA, neizreagirani NTP-ovi, zatvarajući enzimi, dvostruko-lančana RNA (dsRNA) i inhibitori malih-molekula, dok se istovremeno postiže izmjena pufera. Nakon jednog koraka filtracije tangencijalnog protoka, većina nečistoća je učinkovito uklonjena, a jedina zaostala proteinska nečistoća koja se može otkriti je RNA polimeraza.
Nakon toga, višestruke kromatografske tehnike se primjenjuju za daljnje pročišćavanje. Uobičajeno korištene metode uključuju afinitetnu kromatografiju, kromatografiju-ekskluzije, kromatografiju-parova reverzne{3}}faze i kromatografiju-ionske izmjene. Kroz ovu kombinaciju ultrafiltracije i sekvencijalne kromatografije, mRNA postiže visoku razinu čistoće.
Kako bi se ispunili zahtjevi formulacije ili skladištenja, matična otopina mRNA ponovno se koncentrira ili razrijedi pomoću membranskih kazeta od 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa ili kolona sa šupljim vlaknima kako bi se precizno prilagodila ciljna koncentracija i zamijenila u konačni pufer formulacije. Konačno, primjenjuje se sterilna-filtracija za kontrolu mikrobnog opterećenja, čime se dovršava privremeno skladištenje i punjenje materijala.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Pročišćavanje mRNA-LNP formulacija
Lipidne nanočestice (LNP) trenutno su najopsežnije proučavani sustav za isporuku mRNA terapeutika. Trenutačno su različite formulacije mRNA-LNP u različitim fazama predkliničkog i kliničkog razvoja. LNP su vrlo osjetljivi na proizvodne procese. Među jediničnim operacijama potrebnim za proizvodnju mRNA-LNP, koncentracija i izmjena pufera putem filtracije tangencijalnog protoka (TFF) kao i sterilna filtracija predstavljaju značajne izazove. Ovi koraci moraju biti pažljivo optimizirani kako bi se osigurala skalabilnost procesa i kvaliteta proizvoda, dok se izbjegavaju problemi kao što su onečišćenje membrane i netočno punjenje filtera.
Nakon enkapsulacije mRNA, za pročišćavanje se koristi tangencijalna filtracija (TFF). Svrha ovog koraka je uklanjanje neinkapsulirane mRNA, slobodnih polimera ili lipidnih materijala, kao i zaostalih otapala iz mRNA i lipida. Budući da mRNA-LNP pokazuju ograničenu stabilnost na sobnoj temperaturi, optimizacija nizvodnih procesa, uključujući TFF, ključna je za održavanje kvalitete proizvoda.
Ključne smjernice za optimizaciju uključuju: odgovarajuće postavljanje transmembranskog tlaka (TMP) i tangencijalne brzine protoka na temelju veličine čestica i stabilnosti mRNA-LNP-ova kako bi se uravnotežila učinkovitost filtracije i stres čestica; odabir membrana ili kolona šupljih vlakana s prikladnim ograničenjima molekulske težine (MWCO, npr. 100 kDa ili 300 kDa) za učinkovito uklanjanje slobodne mRNA, nečistoća i pufera za razmjenu uz minimiziranje adsorpcije ili oštećenja čestica; i optimiziranje volumena koncentracije i dijafiltracije kako bi se osigurala učinkovita izmjena pufera u ciljanu formulaciju i kontrolirala konačna koncentracija i disperzija čestica.
Osim toga, kritični atributi kvalitete (kao što su veličina čestica, indeks polidisperznosti [PDI] i učinkovitost enkapsulacije mRNA) moraju se pomno pratiti tijekom procesa, a parametri se dinamički prilagođavaju na temelju-podataka u stvarnom vremenu kako bi se postiglo stabilno, skalabilno i učinkovito pročišćavanje i formulacija mRNA-LNP-ova.
Osim toga, zbog nestabilnosti mRNA-LNP-ova i njihovih komponenata u metodama terminalne sterilizacije, 0,2 µm sterilni-filtar obično se koristi za uklanjanje bakterija i drugih mikrobnih kontaminanata.