Kakav je utjecaj koncentracije ulazne tvari na ultrafiltracijske kasete?

Kad sam prvi put počeo raditi s kazetama za ultrafiltraciju (UF) u svojim ranim danima kao dobavljač filtara, priznajem da nisam previše razmišljao o koncentraciji hrane osim provjere je li otopina koju obrađujem "dovoljno gusta". To se brzo promijenilo - kada je biotehnološki klijent udario u zid svojim korakom koncentracije antitijela, okrivljujući česta začepljenja i čudne nedosljedne brzine protoka. Ispostavilo se da su gurali mnogo više nego što je njihova UF kazeta mogla podnijeti, a to ih je koštalo dana prekida rada i serije skupih proizvoda. Ako radite s UF kazetama, ovo nije samo mali detalj – to je jedna od najvećih poluga koja čini ili kvari vaš proces, od prinosa do vremena rada. Razjasnimo kako koncentracija hrane utječe na svaki dio UF-a i što sam naučio tijekom godina kako bi stvari tekle glatko.

Prvo, uzemljimo ovo u ono što UF kazete zapravo rade, samo da budemo sigurni da smo na istoj stranici. Ako ste novi u igri, UF kazeta je samostalna jedinica s ravnim membranama (pogledajte našeKaseta s ravnim listovimastranica za potpunu raščlambu) koja razdvaja molekule po veličini—male stvari prolaze kroz membranu, dok se one veće "zadržavaju" i koncentriraju na strani napajanja. Što ih čini toliko popularnima u biofarmaciji, hrani i piću te otpadnim vodama? Kompaktne su, za višekratnu upotrebu (ponekad, ako se pravilno očiste) i mnogo su dosljednije od starijih, ručno rezanih membranskih postava. TheKasete UltrafiltracijaLinija koju nudimo izgrađena je za skalabilne serije, od malih laboratorijskih serija do potpune proizvodnje, zbog čega smo radili s klijentima u rasponu od početnih biotehnoloških tvrtki do globalnih prehrambenih marki.

Koncentracija hrane, za one koji nisu dublje zaronili u terminologiju, u osnovi je količina ciljne (ili neželjene) otopljene tvari u otopini koju pumpate u kasetu. Na primjer, ako koncentrirate monoklonska antitijela (mAbs) iz bujona stanične kulture, koncentracija u hrani ovdje je koliko grama mAb ima po litri tog bujona. Nije ni to samo meta—pomiješane su i nečistoće poput staničnih ostataka, komponenti medija i ostataka puferskih soli. Slatka točka za koncentraciju hrane je različita ovisno o graničnoj vrijednosti molekularne težine vaše membrane (MWCO), zar ne? UF kazeta od 30 KD izvrsno radi za male proteine, dok je ona od 500 KD za veće molekule poput virusnih vektora. Vidio sam kako klijenti grabe prvu kasetu koju pogledaju, bez obzira na koncentraciju hrane, i tu počinju greške.

Počnimo s najneposrednijim utjecajem: stopom toka. Protok je volumen otopine koja prolazi kroz membranu po jedinici površine na sat—to je okosnica UF produktivnosti. Kada je vaša koncentracija hrane previsoka, tok opada brzo, a ne linearno. Evo zašto: dok obrađujete otopinu, zadržane otopljene tvari nakupljaju se u blizini površine membrane, tvoreći ono što se naziva "koncentracijski polarizacijski sloj". Taj sloj djeluje kao dodatna barijera, tako da voda i male otopljene tvari moraju više raditi da prođu. Ako je koncentracija punjenja izuzetno visoka, taj polarizacijski sloj brzo postaje debeo i uskoro jedva probijate propusnu tvar. Imao sam klijenta prošle godine koji je koristio kazetu za ultrafiltraciju od 30KD na gustom supernatantu stanične kulture - hranili su se s 25 g/L proteina, dok je naša preporuka bila 10-15 g/L. Njihov protok je pao sa 60 L/m²/h na 12 L/m²/h u 2 sata, pa su se morali isključiti kako bi prerano očistili kasetu, gubijući 12 sati rada. Još gore, polarizacija visoke koncentracije dovela je do toga da su neki proteini zapeli u tom sloju, pa je njihov prinos bio 18% manji od očekivanog.

Ali to nije samo fluks—koncentracija hrane također je izravno povezana s onečišćenjem membrane, što je veliki bauk UF-a. Obraštaj je kada se otopljene tvari, krhotine ili agregati trajno zalijepe za površinu membrane ili stijenke pora, a to je još gore s prekoncentriranom hranom. Kada su otopljene tvari natrpane zajedno u hrani, veća je vjerojatnost da će se sudariti s membranom i ostati zarobljene. Očistio sam stotine UF kazeta tijekom godina, i 80% vremena, teška prljavština dolazi do koncentracije hrane koja je bila 2-3 puta veća od preporučenog raspona. Na primjer, klijent za hranu koji je prerađivao voćni sok želio je koncentrirati na 30° Brixa u jednom prolazu, umjesto na 15° Brixa (što je slatka točka za njihovu kazetu od 10KD). Pektin i šećer iz soka počeli su se nakupljati na membrani u roku od 30 minuta, a do kraja ciklusa, pore membrane su bile djelomično blokirane, tako da su dobili samo četvrtinu koncentracije koju su očekivali, i morali su zamijeniti kasetu nakon tri ciklusa umjesto 10. To je dovelo do znatno viših troškova po litri nego da su koncentraciju podijelili u dva prolaza s nižom koncentracijom hrane svaki put.

Prinos je još jedno područje gdje koncentracija hrane teško pogađa, posebno u biofarmaciji gdje je svaki gram proizvoda bitan. Kada je vaša hrana previše koncentrirana, ne samo da dolazi do većeg zaprljanja, već također počinjete primjećivati ​​gubitak proizvoda na dva načina. Prvo, koncentracijski polarizacijski sloj može uhvatiti ciljane molekule, a ako postane predebeo, te bi molekule mogle biti odnesene s retentatom kada ispraznite kazetu, umjesto da budu koncentrirane. Drugo, neke ciljne molekule (poput proteina) mogu se početi agregirati pri visokim koncentracijama, a ti su agregati često dovoljno mali da prođu kroz membranu ili zaglave u permeatu, pa ih izgubite. Klijent virusnog vektora s kojim sam radio prošle godine koristio je našu ultrafiltracijsku kazetu od 500KD za koncentriranje AAV vektora—pogurali su koncentraciju hrane na 1e13 vektorskih genoma po ml, što je puno više od naše preporuke od 2e12. Njihov prinos bio je samo 45%, naspram 82% koji su dobili kada su spustili koncentraciju hrane na pravi raspon. Kada smo testirali retentat, otkrili smo da je 30% njihovog ciljnog vektora zapelo u koncentracijskom polarizacijskom sloju, a drugih 15% je agregirano i izgubljeno. To je vrsta pogotka koji cijelu seriju može učiniti bezvrijednom, posebno kada imate posla s GMP-kompatibilnim procesima gdje ne možete jednostavno napraviti više proizvoda na brzinu.

Pričekajte, ali prije nego što pomislite da je "niža koncentracija hrane uvijek bolja"—ni to nije točno. Ako je vaša hrana previše razrijeđena, gubite vrijeme i kapacitet kazete. UF je najučinkovitiji kada koncentrirate otopinu na razumnu razinu, ali ako počnete s prerijetkim punjenjem, pomičete mnogo više volumena nego što je potrebno, što povećava troškove energije za pumpanje i treba više vremena da se postigne ciljna koncentracija. Na primjer, klijent laboratorija koji je koncentrirao mali uzorak proteina koristio je kazetu od 10KD s koncentracijom hrane od 0,1 mg/mL—pokušavali su postići 10 mg/mL, pa su obrađivali 100 mL otopine da bi dobili 10 mL retentata. Trebalo im je 8 sati, naspram 2 sata kada su prvo koncentrirali hranu centrifugiranjem na 0,5 mg/mL, tako da su obradili samo 20 mL. To je ogromna razlika u radu i vremenu, pogotovo ako radite s više serija dnevno. Ključ je postići taj srednji raspon—ono što ja nazivam "prozor koncentracije" za vašu specifičnu kasetu i primjenu.

Dakle, kako shvatiti taj koncentracijski prozor? Nije univerzalna za sve, ali postoji nekoliko osnovnih pravila koja dijelimo sa svim našim klijentima. Prvo provjerite MWCO svoje kazete: kazeta s višim MWCO (kao 500KD) obično može podnijeti veću koncentraciju hrane od one s nižom MWCO (kao 30KD), jer su pore veće, pa je polarizacija manji problem. NašeKazete-TFF-filtracijska serijastranica ima specifične raspone koncentracija za svaku kazetu, ali kao opće pravilo, nikad ne prelazite 10-15% ukupnih čvrstih tvari za većinu aplikacija proteina i 5-10% za male molekule. Drugo, ispitajte svoju hranu za nečistoće: ako vaša hrana ima puno krhotina ili agregata, potrebna vam je niža koncentracija hrane kako biste izbjegli onečišćenje, bez obzira koja je vaša ciljna molekula. Treće, prvo pokrenite male testove—nemojte samo uskočiti u punu proizvodnju. Testiranje od 100 mL ili 1 L točno će vam reći koji fluks dobivate, koliko brzo dolazi do onečišćenja i koji prinos možete očekivati, tako da ne gubite vrijedan proizvod.

Još jedna stvar koju sam primijetio tijekom godina je da koncentracija hrane djeluje u interakciji s drugim parametrima procesa, poput brzine protoka i transmembranskog tlaka (TMP). To nije kao podešavanje koncentracije u vakuumu—ako imate visoku koncentraciju hrane, možete to malo nadoknaditi povećanjem brzine poprečnog protoka, što uklanja polarizacijski sloj od površine membrane, i povećanjem TMP (ali ne previše, jer TMP može uzrokovati zbijanje polarizacijskog sloja). Ali ovo je čin ravnoteže: veći poprečni protok znači više energije, a veći TMP može dovesti do oštećenja membrane ako niste oprezni. Uvijek savjetujemo klijentima da provedu pune testove parametara koji uključuju koncentraciju hrane, jer promjena jednog može izbaciti druge. Na primjer, klijent je jednom pokušao popraviti pad protoka zbog visoke koncentracije punjenja pojačavanjem TMP-a, a završio je sabijanjem membrane, tako da su njihovi sljedeći ciklusi imali još niži protok. Zato u našoj tvrtki ne prodajemo samo kazete - mi pomažemo našim klijentima da riješe ove procesne zagonetke, jer smo vidjeli gotovo svaku pogrešku koju možete napraviti s koncentracijom hrane.

Razgovarajmo io dugoročnim učincima, jer koncentracija hrane ne utječe samo na jednokratnu vožnju – ona utječe na životni vijek kazete. Ako radite s prekoncentriranom hranom, stvarate mnogo više prljavštine, što znači da morate češće čistiti kasetu i agresivnija sredstva za čišćenje (kao što je viši pH ili temperatura) da biste se riješili naslaga. S vremenom, to agresivno čišćenje degradira membranu, tako da kaseta ima manje puta prije nego što je treba zamijeniti. Imao sam klijenta koji je koristio našu kasetu s ravnim listovima, i do 5. vožnje morali su je zamijeniti zbog velikog zaprljanja, dok je drugi klijent koji je pokretao istu kasetu s pravom koncentracijom dodavanja dobivao 15+ pokreta. To je ogromna razlika u cijeni kada prolazite kroz kasete svaki tjedan u odnosu na svaki mjesec.

Sada, idemo praktično – što biste zapravo trebali učiniti ako vam je koncentracija hrane smanjena? Najprije ga pravilno izmjerite. Mnogi klijenti koriste "vizualnu debljinu" otopine, što je super netočno. Koristite Brix metar za prehrambene proizvode ili apsorbanciju (poput A280 za proteine) da biste dobili preciznu koncentraciju. Zatim prilagodite svoju hranu tako da je razrijedite (ako je previsoka) ili je dodatno koncentrirate s manjim korakom predobrade (poput filtracije tangencijalnog protoka s drugom kazetom ili centrifugiranjem) ako je preniska. Ako imate posla s jedinstvenom hranom, poput prilagođenog biološkog lijeka, obratite se našem timu—imamo stručnjake za aplikacije koji vam mogu pomoći u dizajniranju procesa prilagođenog vašoj koncentraciji hrane, bilo da se radi o odabiru pravog MWCO (kao što je 30KD naspram 500KD), podešavanju unakrsnog protoka ili pronalaženju najboljeg vremena rada.

Ne mogu dovoljno naglasiti koliko mala podešavanja koncentracije hrane mogu promijeniti vaš cijeli UF proces. To nije dosadan detalj—to je razlika između izvođenja koje pogađa sve vaše ciljeve u pogledu prinosa i vremenskog okvira i izvođenja koje vam ostavlja da danima rješavate probleme, rasipate proizvod i novac. Izgradili smo svojeKasete Ultrafiltracijalinija biti fleksibilna, s opcijama za različite MWCO (poput našegUltrafiltracijske kasete od 30kdiUltrafiltracijske kasete od 500KD), dizajn ravnih listova i postave serije TFF, jer znamo da je feed svakog klijenta drugačiji. Ako se borite s problemima koncentracije hrane ili samo želite učiniti vaš UF proces učinkovitijim, mi smo tu da vam pomognemo—radili smo s tisućama klijenata kako bismo dobili ispravne prozore koncentracije, a možemo učiniti isto za vas. Ne dopustite da vam mali detalj kao što je koncentracija hrane uništi vaše trke—obratite se našem timu i saznajte više o optimizaciji vašeg procesa danas.

Reference

1. Belfort, G., Davis, RH i Zydney, AL (1994). Ponašanje suspenzija i makromolekulskih otopina u unakrsnoj mikrofiltraciji. Journal of Membrane Science, 96(1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Hidrodinamička i koncentracijska polarizacija u ultrafiltraciji: pregled. Desalinizacija, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Filtracija tangencijalnog protoka za biofarmaceutsku obradu. Current Opinion in Chemical Engineering, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Osnovni principi membranske tehnologije (2. izdanje). Kluwer Academic Publishers.