Osnovni principi i tijek rada sinteze peptida čvrste-faze (SPPS)

Sinteza peptida čvrste-faze (SPPS)je metoda za sintezu peptida na čvrstoj podlozi. Glavne SPPS strategije uključujuBoc metodaiFmoc metoda. Sinteza peptida je ponavljajući proces sekvencijalnog dodavanja aminokiselina i općenito se izvodi izC-kraj (karboksilni kraj)naN-kraj (amino kraj). Prvo, karboksilna skupina prve aminokiseline ciljnog peptida je kovalentno vezana na krutu podlogu (smolu). Koristeći amino skupinu ove aminokiseline kao početnu točku, uklanja se N-terminalna zaštitna skupina, a rastući peptidni lanac se produljuje reakcijom s viškom aktivirane druge aminokiseline. Ovaj ciklus-spajanje → pranje → uklanjanje zaštite → neutralizacija i pranje → sljedeće spajanje- se ponavlja dok se ne postigne željena duljina peptida. Konačno, peptidni lanac se odcjepljuje od smole i pročišćava kako bi se dobio ciljni peptid. Kada je -amino skupina zaštićena sBoc (tert-butiloksikarbonil), metoda se nazivaBoc-temeljena sinteza čvrste{1}}faze peptida. Kada je -amino skupina zaštićena sFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil), poznata je kaoSinteza peptida čvrste-faze zasnovana na Fmoc-.

 

Boc-temeljena sinteza peptida u čvrstoj-fazi (Boc metoda)

uBoc metoda, Boc skupine koje se mogu ukloniti trifluoroctenom kiselinom (TFA)koriste se za zaštitu -amino skupina, dokzaštitne skupine benzil-tipakoriste se za bočne lance. Tijekom sinteze, Boc-zaštićena -aminokiselina je prvo kovalentno povezana sa smolom. Boc skupina se zatim ukloni s TFA, a rezultirajući slobodni amino terminus se neutralizira s trietilaminom. Sljedeća aminokiselina se aktivira pomoćuDCC (dicikloheksilkarbodiimid)i spojeni da produže peptidni lanac. Nakon dovršetka sklapanja, ciljani peptid se cijepa od smole pomoću jake kiseline, običnobezvodni fluorovodik (HF)ilitrifluorometansulfonska kiselina (TFMSA)U metodi Boc sinteze, potrebni su ponovljeni tretmani kiselinom za uklanjanje zaštitnih skupina prije svakog koraka spajanja. To može dovesti do nekoliko nuspojava, kao što je prerano cijepanje peptida od smole i nestabilnost bočnih lanaca aminokiselina u kiselim uvjetima, što dovodi do neželjenih nuspojava.

 

Fmoc-temeljena sinteza peptida u čvrstoj-fazi (Fmoc metoda)

U1978, Meienhofer i Athertonrazvio strategiju sinteze peptida pomoćuFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil)kao -amino zaštitna skupina, poznata kaoFmoc metoda. U ovom pristupu, -amino skupina je zaštićena sbaza-labilan Fmoc, dok su bočni lanci zaštićeni sacid-labilne Boc-zaštitne skupine.Glavna prednost Fmoc-a kao amino{1}}zaštitne skupine je njegovastabilnost u kiselim uvjetima; na njega ne utječe tretman reagensima kao što sutrifluoroctena kiselina (TFA)i može se selektivno ukloniti pomoćublaga baza. U isto vrijeme, zaštitne skupine bočnog-lanca kao što je Boc stabilne su u bazičnim uvjetima i uklanjaju se pod kiselim tretmanom. Konačno, peptid se kvantitativno odcjepljuje od smole pomoćuTFA/diklormetan (DCM), izbjegavajući upotrebu jakih kiselina i time poboljšavajući sigurnost i kompatibilnost s rutinskom sintezom peptida.

 

Povijest razvoja sinteze peptida čvrste-faze (SPPS)

1. Temeljna faza (početak 20. stoljeća do 1963.)

U1902, Emil Fischerje prvi istražio sintezu peptida, ali je napredak bio spor zbog tehničkih ograničenja. Korištene rane sintezebenzoilne i acetilne zaštitne skupine, koje je bilo teško ukloniti i često su dovodile docijepanje peptidnog lanca.

U1932, Max Bergmanni -suradnici su predstavilibenziloksikarbonilna (Z) skupinakao -amino zaštitnu skupinu. Ova se grupa može ukloniti podkatalitička hidrogenacija ili kiseli uvjeti, pružajući pouzdaniji alat za sintezu peptida i postavljajući temelje za razvoj sinteze peptida čvrste -faze 1960-ih.

Tijekom1950sznanstvenici su uspješno sintetizirali raznebiološki aktivni peptidi, kao što jeoksitocin i inzulin. Ta su postignuća dodatno unaprijedila kemiju peptida i postavila temelje za pojavu sinteze peptida u čvrstoj-fazi.

 

2. Pionirska pozornica (1963.)

U1963, Robert B. Merrifieldpredložio jemetoda sinteze peptida čvrste{0}}faze (SPPS)., u kojem jeC-terminalna aminokiselinausidren je na smolasti nosač, a peptidni lanac se izdužuje kroz ponovljene cikluseskidanje zaštite i spajanje. Ovaj pristup uvelike je pojednostavio proces sinteze peptida i postaopreferirana metodaza sastavljanje peptida.

Merrifield je koristioBoc (tert-butiloksikarbonil)za zaštitu -amino skupine. Do kasnih 1960-ih, također je razvioprvi potpuno automatizirani sintetizator peptidai uspješno sintetiziranbiološke bjelančevinekao nprribonukleaza (124 aminokiseline). Za ova revolucionarna postignuća Merrifield je dobio nagraduNobelova nagrada za kemiju 1984.

 

3. Faza tehnološke inovacije (1972.)

U1972, Lou Carpinorazvio je9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) zaštitna skupina, što može bitinježno ukloniti pod osnovnim uvjetima, smanjujući nuspojave. To ga je učinilo posebno pogodnim zasloženi peptidiiautomatizirana sinteza.

TheFmoc metodapostupno zamijenio Boc metodu kao glavnu strategiju. Automatizirani sintetizatori peptida temeljeni na obaFmoc i Boc kemijasu kasnije razvijeni, pokrećućiautomatizacija sinteze peptidai značajno poboljšava učinkovitost i ponovljivost.

 

4. Faza zrelosti i ekspanzije (1990-ih do danas)

Optimizacija smole i reagensa:Razvoj odvisoko{0}}opterećene, hidrofilne PEG-modificirane smolei učinkoviti reagensi za spajanje kao što suHBTUiHATUznačajno je poboljšao učinkovitost i prinos sinteze peptida čvrste-faze (SPPS).

Tehnološka integracija:Novi pristupi poputsinteza-potpomognuta mikrovalovimaikemija protokaskratili su reakcijska vremena i dodatno povećali prinose.

 

Osnovna načela i tijek rada SPPS-a:
Temeljni princip sinteze peptida čvrste-faze jepostupna izgradnja peptidnog lanca na čvrstom nosaču, koristećištiteći grupne strategijeireakcije kondenzacije (spajanja).postićiučinkovito i kontrolirano sklapanje peptida.

1. Uloga čvrstog nosača (smola) u sintezi peptida u čvrstoj-fazi (SPPS)

A netopljiva polimerna smola-kao što jepolistiren-divinilbenzen unakrsno-povezana smola, Wangova smola ili Rink amidna smola-odabran je kao čvrsta podrška u SPPS-u. Površina smole sadržifunkcionalne skupine(npr. hidroksilne ili amino skupine) koje mogu nastatikovalentne veze s jednim krajem peptidnog lanca, običnoC-kraj, pričvršćujući peptid na čvrsti nosač. Ova kovalentna veza osigurava da rastući peptidostaje vezan za smolu tijekom cijele sinteze, što uvelikeolakšava sljedeće reakcijske korake, pranje i pročišćavanje

 

2. Strategija zaštite grupe u sintezi peptida čvrste -faze (SPPS)

Tijekom sinteze peptida,-amino skupina, karboksilna skupina i funkcionalne skupine reaktivnog bočnog-lancaaminokiselina (kao što su tiol, karboksil i amino skupine) su skloninuspojave. Kako biste spriječili ove neželjene reakcije,zaštitne skupinekoriste se. Uobičajene zaštitne skupine uključuju:-Amino zaštitne skupine:

Boc (tert-butiloksikarbonil):Otporan-na kiseline, lako se uklanja podkiselim uvjetima.

Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil):Stabilan u kiselim uvjetima, može se ukloniti podosnovni uvjeti(npr. piperidin/DMF otopina).Zaštitne grupe-bočnog lanca:Odabrano prema kemijskim svojstvima bočnog lanca aminokiselina.uobičajene skupine uključujubenzil (Bn), tert-butil (tBu), tritil (Trt), itd.Ove grupe suuklonjen na kraju sinteze, obično tijekom cijepanja peptida iz smole, korištenjemkiselinom ili drugim specifičnim uvjetima.

 

3. Sinteza C-kraja do N-terminusa u SPPS-u

Usinteza peptida čvrste-faze (SPPS), sklapanje peptida obično počinje naC-kraj (karboksilni kraj)i nastavlja stepenasto premaN-kraj (amino kraj). To je zato štoC-terminalna aminokiselina najprije se veže za čvrsti nosač, a sljedeće aminokiseline se spajaju naslobodna amino skupina peptidnog lanca već vezana za smolu, postupno izdužujući peptidni lanac.

 

4. Reakcija spajanja u čvrstoj -fazi peptidne sinteze (SPPS)

Zaštićene aminokiseline moraju bitiaktivirantako da njihovkarboksilne skupine postaju reaktivne, dopuštajući im da formiraju apeptidna vezas amino skupinom peptida-vezanog za smolu. Uobičajenoreagense za aktiviranjeuključitikarbodiimidi(npr. DCC, DIC),HOBt, HATU, iPyBOP. Jednom aktivirana, karboksilna skupina reagira sa slobodnom amino skupinom u areakcija kondenzacije, tvoreći anamidna vezai time pričvrstiti novu aminokiselinu za rastući peptidni lanac.

 

5. Ponavljajuće (cikličke) operacije u sintezi peptida u čvrstoj-fazi (SPPS)

Proces uključujeponavljanje ciklusa deprotekcije → spajanje → pranje, dodajućijedna aminokiselina po ciklusuza postupno produljenje peptidnog lanca. Nakon svakereakcija spajanja, smola jeopran(npr. s otapalima kao što su DMF ili DCM) za uklanjanje neizreagiranih reagensa, nus-proizvoda i viška aminokiselina. The-amino skupini novododanog ostatka tada se uklanja zaštita, izlažući slobodni amin da se pripremi za sljedeću reakciju spajanja. Ovaj ciklus se ponavlja dok se željena peptidna sekvenca potpuno ne sastavi.

 

6. Cijepanje u čvrstoj-fazi peptidne sinteze (SPPS)

Jednom kada peptidni lanac dosegne željenu duljinu, on jeodcijepljena od čvrstog nosačakorištenjem odgovarajućeg reagensa, dok istovremenouklanjanje svih zaštitnih grupa. Često korišteni reagens za cijepanje jetrifluoroctena kiselina (TFA), koji ne samorazbija vezu između peptida i smoleali takođeruklanja zaštitne skupinekao što su Fmoc i Boc, vraćajući peptid u njegovrodna država. Jednom kada peptidni lanac dosegne željenu duljinu, on jeodcijepljena od čvrstog nosačakorištenjem odgovarajućeg reagensa, dok istovremenouklanjanje svih zaštitnih grupa. Često korišteni reagens za cijepanje jetrifluoroctena kiselina (TFA), koji ne samorazbija vezu između peptida i smoleali takođeruklanja zaštitne skupinekao što su Fmoc i Boc, vraćajući peptid u njegovrodna država.

Kroz ove korake,sinteza peptida čvrste-faze (SPPS)omogućujeučinkovito i kontrolirano sklapanje peptidnih lanaca na čvrstom nosaču, izbjegavajući komplicirane međukorake pročišćavanja potrebne u tradicionalnoj sintezi otopine-faze i značajnopoboljšanje učinkovitosti sinteze i prinosa.

Kroz ove korake,sinteza peptida čvrste-faze (SPPS)omogućujeučinkovito i kontrolirano sklapanje peptidnih lanaca na čvrstom nosaču, izbjegavajući komplicirane međukorake pročišćavanja potrebne u tradicionalnoj sintezi otopine-faze i značajnopoboljšanje učinkovitosti sinteze i prinosa.