Primjena odUltrafiltracija uEekstrakcija odNprirodanColagen

 

Ⅰ.Što je kolagen

Kolagen je biopolimer, glavna komponenta u vezivnom tkivu životinja, a također i najzastupljeniji i najrasprostranjeniji funkcionalni protein kod sisavaca, koji čini 25%-30% ukupnih proteina, a kod nekih i do više od 80%. organizmi. Ima ulogu vezivnog tkiva u životinjskim stanicama.

Prema mjerenju, odrasla osoba ima oko 3 kg kolagena u svom tijelu, koji je uglavnom prisutan u koži, kostima, očima, zubima, tetivama, unutarnjim organima (uključujući srce, želudac, crijeva i krvne žile) i drugim dijelovima ljudskog tijela. Njegova funkcija je održavanje morfologije i strukture kože i organa, a također je važna sirovina za obnovu oštećenih tkiva.

II. Ekstrakcija kolagena iz ljuski amura ultrafiltracijom

1. Materijali i metode

1.1 Ispitni uzorci

Vodeni ekstrakt sirovog kolagena.

1.2 Metode ispitivanja

1.2.1 Proces ultrafiltracije

1.2.2 Određivanje procesa predfiltracije

U ovom se ispitivanju usporednom analizom metode vakuumske filtracije i metode mikrofiltracije utvrđuje optimalni postupak predfiltracije. Specifične ispitne metode su sljedeće:

① Vodeni ekstrakt sirovog kolagena filtrira se metodom vakuumske filtracije s filter papirom kako bi se uklonile suspendirane čestice i nečistoće u vodenom ekstraktu.

② Vodeni ekstrakt sirovog kolagena filtrira se mikrofiltracijskom membranom 0.2 μm kako bi se uklonile netopljive tvari, nečistoće itd. u vodenom ekstraktu.

1.2.3 Izbor veličine pora ultrafiltracijske membrane

Tijekom pročišćavanja, veličina pora ultrafiltracijske membrane je 100 kDa.

1.2.4 Eksperiment s jednim faktorom procesa ultrafiltracijskog pročišćavanja

Vodeni ekstrakt sirovog kolagena pročišćava se tehnologijom ultrafiltracije. Proučite eksperiment s jednim faktorom učinka radnog tlaka, radne temperature i pH na zadržavanje kolagena. Nakon pokretanja opreme za ultrafiltraciju određeno vrijeme, proučite učinak različitih čimbenika na stopu zadržavanja kolagena.

1.2.5 Formula za izračun

2. Rezultati i analiza

2.1 Analiza procesa predfiltracije

Pogledajte donju tablicu za rezultate usporedbe metode vakuumske filtracije i metode mikrofiltracije.

Metoda filtracije	Koncentracija otopine prije filtracije/(g/L)	Koncentracija otopine nakon filtracije/(g/L)	Osjetilni fenomeni
metoda vakuumske filtracije	0.45	0.35	Otopina je bistra na kraju filtracije, ali postaje mutna nakon što je odstajala neko vrijeme.
metoda mikrofiltracije	0.45	0.42	Otopina je bistra na kraju filtracije i ostaje bistra nakon što je ostavljena neko vrijeme

 

Iz tablice se može vidjeti da i metoda vakuumske filtracije i metoda mikrofiltracije mogu ukloniti nečistoće i netopljive krute tvari u otopini, ali metoda mikrofiltracije ima bolji zaštitni učinak na proteine, odnosno gubitak nije značajan, a metoda vakuumske filtracije može uzrokovati gubitke proteina. Osim toga, filtrat je zamućen nakon što je neko vrijeme bio postavljen vakuumskom filtracijom, dok je mikrofiltracija još uvijek bistra i prozirna, tako da je mikrofiltracija odabrana kao postupak predtretmana ultrafiltracije.

2.2 Jednofaktorsko ispitivanje procesa ultrafiltracije

2.2.1 Učinak tlaka ultrafiltracije na stopu zadržavanja

U uvjetima temperature od 40 stupnja i pH 9.0, proučite učinke različitih ultrafiltracijskih tlakova (0.07MPa, 0.{ {11}}9 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa i 0,15 MPa) na stopu zadržavanja proteina. Rezultati su prikazani na slici ispod.

 

Kao što se može vidjeti na gornjoj slici, s povećanjem radnog tlaka, stopa presretanja proteina postupno se smanjivala. Na {{0}}.07MPa, stopa zadržavanja proteina je 96,53%, kada je radni tlak 0,15MPa, stopa zadržavanja proteina je 84,38%. To je zato što je odvajanje tvari ultrafiltracijom potaknuto razlikom tlaka. U tom rasponu niskog radnog tlaka male molekularne tvari mogu brzo proći kroz membranu, ali makromolekularne tvari mogu biti zarobljene ultrafiltracijskom membranom i akumulirati se na površini membrane, a trenutno površina membrane i vodeni sloj izvući iz koncentracijske razlike da izazove koncentracijsku razliku polarizacijski otpor; međutim, s povećanjem tlaka, koncentracijski polarizacijski otpor postupno raste, a koncentracijska razlika između površine membrane i vodenog ekstrakta postiže ravnotežu. Kada tlak prijeđe ovu ravnotežu, na površini membrane mogao bi se ispisati sloj gela (što je bilo u skladu s teorijom koncentracijske polarizacije i sloja gela koji se formira tijekom ultrafiltracije). Pritisak nastavlja rasti, a debljina sloja gela se povećava, a protein koji ostaje na površini membrane se povećava, što rezultira niskom stopom zadržavanja. Kako bi se osigurao učinak odvajanja membrane, optimalni parametar radnog tlaka je 0,07MPa.

2.2.2 Učinak temperature na stopu zadržavanja proteina

U uvjetima tlaka {{0}}.11MPa, pH 9,0, proučite učinke različitih temperatura (25 stupnjeva, 30 stupnjeva, 35 stupnjeva, 40 stupnjeva i 45 stupnjeva) na zadržavanje proteina. Rezultati su prikazani na slici ispod.

 

Kao što je prikazano na gornjoj slici, s povećanjem temperature, stopa zadržavanja ultrafiltracijske membrane postupno raste i doseže maksimum na 45 stupnjeva, sa stopom zadržavanja od 97,01%. Budući da je viskoznost kolagena usko povezana s temperaturom: kada je temperatura niža, viskoznost kolagena je veća, pa stoga kolagen lako stvara otpor na površini membrane, što rezultira niskom stopom zadržavanja. Kada se temperatura poveća, viskoznost kolagena se smanjuje i interakcija između molekula kolagena je slabljena, tako da se brzina prijenosa mase povećava, a koncentracijska polarizacija slabi, čime se povećava stopa zadržavanja. Drugi razlog za povećanje stope zadržavanja je taj što se temperatura povećava, a topivost kolagena se u skladu s tim povećava, a pojava blokiranja kolagena na membrani je smanjena. Stoga je optimalna temperatura za ultrafiltraciju 45 stupnjeva.

2.2.3 Učinak pH na zadržavanje proteina

U uvjetima tlaka {{0}}.11MPa i temperature 40 stupnja, proučite učinke različitih pH uvjeta, naime pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 i pH=10.0, na stopu zadržavanja. Rezultati su prikazani na slici ispod.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, stopa zadržavanja postupno raste s porastom pH. To je zato što je ultrafiltracijska membrana polieterska javorova membrana s negativnim nabojem, kolagen s negativnim nabojem u alkalnim uvjetima, negativno nabijene molekule kolagena i ultrafiltracijska membrana s istim nabojem čine međusobno isključivo stanje, tako da molekule kolagena nije lako ostati na površini membrane, nije lako blokirati membranu, pa je optimalni pH ultrafiltracije 8-10.

2.3 Optimizacija procesa ultrafiltracije i validacija rezultata

Analiza softvera Design-Expert8.05 pokazuje da su optimalni procesni parametri sljedeći: radni tlak 0.14MPa, radna temperatura 40,98 stupnjeva i pH otopine=9.43. Pod ovim uvjetima, stopa zadržavanja bila je 92,551%. Uzimajući u obzir operativnost stvarnih parametara, radni tlak je 0,14 MPa, radna temperatura je 40 stupnjeva, a pH vrijednost napojne tekućine je 9,50 pod uvjetima ultrafiltracije. Eksperimentalna provjera započinje nakon što se sustav uređaja za ultrafiltraciju počne stabilizirati. Dobiveni rezultat stope zadržavanja je (92.61 0.1)% (n=3). Predviđena vrijednost jednadžbe u osnovi je slična izmjerenoj vrijednosti, što pokazuje da je predviđeni rezultat uvjetnog parametra u skladu sa stvarnim uvjetnim rezultatom.

2.4 Rezultati analize elektroforeze

Pročišćeni kolagen analizira se SDS-PAGE elektroforezom, a rezultati su prikazani na slici ispod.

Kao što je prikazano na gornjoj slici, linija 1 je pročišćeni kolagen u ovom eksperimentu, a linija 2 je standardni uzorak kolagena tetive potkoljenice. Iz SDS-PAGE elektroforeze moglo se vidjeti da se protein kolagena predložen u ovom eksperimentu može identificirati kao kolagen, ali naizgled nejasne granice a1 peptidnog lanca i a2 peptidnog lanca nisu jasne. Iz elektroforeze je jasno da nema drugih proteinskih traka, te se može zaključiti da je čistoća pročišćenog kolagena visoka.