Nizvodni proces koncentracije ultrafiltracije/dijafiltracije: Kako učinkovito spriječiti prodiranje i gubitak ciljanog proteina
Nizvodni proces koncentracije ultrafiltracije/dijafiltracije: Kako učinkovito spriječiti prodiranje i gubitak ciljanog proteina
U nizvodnim procesima pročišćavanja za rekombinantne proteine, krvne proizvode i druge biološke lijekove, ultrafiltracija/dijafiltracija (UF/DF) koristi se za koncentraciju sirovine, izmjenu pufera i uklanjanje soli i nečistoća malih-molekula. Razdvajanje se postiže na temelju membranskog prosijavanja: velike molekule poput monoklonskih protutijela (mAbs) zadržava membrana, dok soli, endotoksini, slobodni proteini stanica domaćina (HCP) i druge nečistoće malih-molekula prolaze kroz membranu i uklanjaju se u permeatu. Tijekom povećanja -procesa, ciljni gubitak proteina kroz membranu može lako doći do izravnog smanjenja prinosa i povećanja troškova serije. U nekim radnim uvjetima, protein se može detektirati u permeatu, što zahtijeva brzo određivanje jesu li iscurjele komponente intaktno ciljano mAb, razgrađeni/fragmentirani agregati ili proteini stanice domaćina. Ovaj je članak podijeljen u dva glavna dijela: daje pregled tradicionalnih pristupa-kontroli procesa i, u kombinaciji s dizajnom eksperimenata (DOE), uspostavlja robustan prozor procesa, podržan s višestrukim analitičkim metodama za utvrđivanje identiteta proteina otkrivenih u permeatu.
I. Ključni uzroci prolaska ciljanog proteina kroz membranu tijekom UF/DF
1. Prekomjerni transmembranski tlak (TMP)
Kada je razlika tlaka preko membrane prevelika, otpor otapala se povećava, tjerajući dio monomernog proteina u permeat. Tijekom povećanja-razmjera, spremnik za punjenje sadrži veći volumen materijala, a fluktuacije tlaka u cjevovodu su izraženije, zbog čega je prolazni nadtlak vjerojatniji nego u laboratorijskim razmjerima.
2. Neodgovarajući tangencijalni protok
Ako je protok prenizak, na površini membrane stvara se gusti koncentracijski-polarizacijski sloj, a lokalna koncentracija proteina može premašiti prag tolerancije membrane. Ako je brzina protoka previsoka, smični stres može uzrokovati strukturno cijepanje mAb, stvarajući manje fragmente proteina koji mogu slobodno proći kroz pore membrane.
3. Pretjerano visoka koncentracija proteina u sirovini
Kada je koncentracija proteina u hrani previsoka, protein se nakuplja na površini membrane, a dio monomernog proteina može biti prenesen u permeat. Ovo je čest problem u-velikoj proizvodnji.
4. pH ili vodljivost izvan raspona procesa
Promjene u karakteristikama naboja proteina mogu smanjiti njegov radijus hidratacije i prividnu veličinu čestica, što rezultira abnormalnom propusnošću membrane.
5. Starenje membranske kasete, veliki difuzijski tok ili nedovoljno pred-kondicioniranje
Fizički nedostaci u membranskoj kazeti mogu izravno uzrokovati curenje proteina i predstavljati-rizik povezan s opremom. Ponovljeni CIP s jako alkalnim otopinama može postupno oštetiti polietersulfonski (PES) materijal membrane.
6. Preveliki volumen dijafiltracije
Tijekom produljene dijafiltracije, kontinuirano ispiranje otapalom može postupno odnijeti male količine monomernog proteina.
II. Tradicionalne praktične mjere za sprječavanje prodiranja i gubitka ciljnih proteina
(A) Kontrola parametara procesa
1. Kontrolirajte transmembranski tlak (TMP)
Definirajte gornju granicu upozorenja za tlak i uspostavite alarme za blokiranje kako biste spriječili prolazne udare visokog{0}}tlaka na sloj membrane. Nakon utvrđivanja osnovnih parametara u maloj mjeri, smanjite siguran radni tlak tijekom -proširene proizvodnje i rezervirajte odgovarajući raspon tolerancije procesa.
2. Optimizirajte brzinu protoka
Uspostaviti stabilan granični sloj i smanjiti polarizaciju koncentracije na površini membrane kroz poprečni protok, čime se smanjuje nakupljanje proteina na površini membrane u izvoru.
3. Ograničite konačnu koncentraciju za koncentracijom
Definirajte granicu koncentracije na temelju fizikalno-kemijskih svojstava proteina i izbjegavajte pretjeranu koncentraciju hrane. Za mAbs, rutinska konačna koncentracija općenito ne prelazi 50 mg/mL; za neka mAb-sklona agregaciji, koncentraciju treba dodatno smanjiti.
4. Kontrolirajte pH i vodljivost hrane
Održavajte stabilnu hidratiziranu veličinu čestica proteina i izbjegavajte molekularnu kontrakciju uzrokovanu poremećajima kiseline/baze ili ionske -snage.
(B) Oprema i operativne kontrole
1. Provedite ispitivanje integriteta membranske kazete prije svake serije
Prije proizvodnje svake serije provedite test-mjehurićima kako biste identificirali slomljena vlakna membrane. Oštećene membranske kazete treba odmah odbaciti kako bi se spriječilo kontinuirano curenje proteina.
2. Standardizirajte postupak CIP čišćenja
Kontrolirajte koncentraciju NaOH i vrijeme kontakta. Nakon jako alkalnog čišćenja, potpuno uravnotežite materijal membrane kako biste smanjili rizik od deformacije pora membrane.
3. Koristite postupnu dijafiltraciju
Upotrijebite veliku{0}}izmjenu međuspremnika tijekom rane faze za uklanjanje soli i usporite protok dijafiltracije kako se krajnja točka približava kako biste smanjili otpor i gubitak proteina.
III. Uspostavljanje prostora za dizajn procesa kroz DOE (QbD karakterizacija procesa; primjenjivo na IND podnesak)
1. Faktorski skrining
Pregledajte pet ključnih parametara procesa UF/DF (P): transmembranski tlak, brzinu protoka hrane, početnu koncentraciju proteina, pH vrijednost hrane i radnu temperaturu.
Varijable odgovora: zadržani prinos, sadržaj proteina u permeatu, protok kroz membranu i postotak agregata velike-molekularne-težine.
Analizom značajnosti identificirajte ključne čimbenike koji doprinose curenju proteina.
2. Modeliranje površine odziva
Odaberite četiri parametra s najvećim značajem za konstrukciju površine odziva i analizu interakcija među parametrima. U mnogim radnim uvjetima, jedan parametar može ostati unutar svog kvalificiranog raspona, dok kombinacija dva parametra može rezultirati prodiranjem proteina. Takvi učinci interakcije ne mogu se identificirati tradicionalnim-faktor---eksperimentima. Na temelju modela definirajte operativni prostor dizajna. Sve dok procesni parametri ostaju unutar ovog raspona, može se osigurati učinkovito zadržavanje proteina dok se nečistoće uklanjaju dijafiltracijom.
3. Izazov u-najgorem slučaju (potrebno za karakterizaciju procesa)
Odaberite procesne parametre na krajnjim radnim granicama za simulaciju varijabilnosti proizvodnje: maksimalni TMP, minimalna brzina protoka i gornja-granična koncentracija proteina. Potvrdite da čak i pod ekstremnim radnim uvjetima ne dolazi do -gubitka ciljnog proteina u velikim razmjerima, čime se ispunjavaju zahtjevi CMC pregleda.
IV. Višestruke analitičke metode za identifikaciju proteina otkrivenih u permeatu i razlikovanje ciljnih mAb, fragmenata razgradnje i HCP
Na temelju analitičke učinkovitosti, troškova i scenarija podnošenja propisa, metode se mogu podijeliti u dvije kategorije: brzi probir i potvrdno testiranje. Brze metode trebale bi imati prioritet za rutinsko praćenje procesa; kada se pojave abnormalna odstupanja, treba koristiti metode precizne identifikacije.
1. UV spektrofotometrija (brzi mrežni pregled; poželjno za rutinsko nadgledanje podova-trgovina)
Prikupite permeat i izmjerite njegovu apsorbanciju A280. Ovo samo može odrediti je li protein prisutan u permeatu i ne može razlikovati vrste proteina. Uglavnom se koristi za rutinsko praćenje procesa. Stalno rastuća vrijednost A280 ukazuje na pogoršanje istjecanja proteina i zahtijeva hitnu obustavu dijafiltracije i ispitivanje procesa.
2. SDS-PAGE elektroforeza (najčešće korištena metoda kvalitativne identifikacije)
Upotrijebite reducirajuću i ne{0}}reducirajuću elektroforezu i usporedite položaje vrpci s onima ciljnog mAb u sirovini:
1) Ako je položaj trake potpuno u skladu s ciljnim mAb, intaktno mAb je prodrlo kroz membranu.
2) Ako se pojave vrpce manje{1}}molekularne-težine, protein je prošao hidrolitičko cijepanje, stvarajući fragmente mAb.
3) Ako su trake raštrkane s više različitih traka, većina su proteini stanica domaćina (HCP) iz E. coli/CHO stanica domaćina, a ne ciljni proizvod.
3. Ekskluziona kromatografija-veličine-velike učinkovitosti (HPSEC)
Odvojite komponente prema veličini molekule i usporedite njihova vremena eluiranja s onima iz kromatograma sirovine:
- Glavni maksimum s istim vremenom zadržavanja kao mAb označava intaktni ciljni protein.
- Vrh koji se ranije eluira ukazuje na agregate/fragmente velike-molekularne-težine.
- Vrh koji se kasnije eluira ukazuje na fragmente razgradnje-molekularne-male mase.
- Odsutnost karakterističnog glavnog vrha ukazuje na HCP nečistoće proteina.
Ova metoda može dati kvantitativne podatke i može se uključiti u izvješća o ispitivanju odstupanja procesa; visoko je prihvaćen u kliničkim materijalima za podnošenje.
4. HCP test -staničnih proteina ELISA kitom
Ako se protein detektira u permeatu, rezultat ELISA testa je povišen, a HPSEC ne pokazuje karakteristični vrh mAb, u osnovi se može odrediti da je iscurjeli materijal protein-domaćina CHO. Ovo ukazuje na nepotpuno uklanjanje nečistoća tijekom prethodnog pročišćavanja; nečistoće se ispiru tijekom UF/DF faze i ne predstavljaju gubitak proizvoda.
5. Provjera afinitetne kromatografije (kromatografija proteina A)
Protein A specifično veže Fc regiju mAbs. Stavite uzorak permeata na kolonu: pojava karakterističnog vrha eluacije ukazuje na prisutnost intaktnog ciljnog antitijela; odsutnost vrha eluiranja pokazuje da su svi proteini u permeatu proteini nečistoće.
6. Masena spektrometrija (LC-MS) (-dubinska sljedivost; koristi se za ispitivanje velikih odstupanja procesa)
LC-MS može izravno analizirati sekvencu aminokiselina i točno odrediti podrijetlo proteina. Uglavnom se koristi za istraživanje teških ili neuobičajenih odstupanja i ne koristi se kao rutina u-kontrolnom testu procesa.
V. Korektivne radnje koje odgovaraju različitim analitičkim rezultatima
1. Intaktno ciljno mAb detektirano u permeatu
Smanjiti transmembranski tlak i konačnu koncentraciju za koncentracijom; suziti radni raspon procesa na temelju DOE rezultata; i provjerite integritet membranske kazete.
2. Fragmenti razgradnje protutijela otkriveni u permeatu
Istražite smično naprezanje tijekom procesa i ekstremne pH vrijednosti; optimizirati prethodni korak inaktivacije virusa kako bi se smanjilo cijepanje proteina.
3. Samo HCP nečistoća proteina otkrivena u permeatu
Nije potrebno podešavanje UF/DF parametara. Pratite problem unatrag do prethodnih kromatografskih koraka i poboljšajte uklanjanje nečistoća tijekom afinitetne i-kromatografije ionske izmjene.
VI. Sažetak
Kako bi se spriječilo curenje proteina tijekom UF/DF, tradicionalna kontrola procesa oslanja se na povijesno iskustvo za definiranje pojedinačnih točaka parametara, koji mogu adekvatno odgovoriti samo na stabilnu proizvodnju malog-razmjera. Kako bi se osigurala stabilna izvedba tijekom postupnog povećanja-procesa, potrebno je koristiti karakterizaciju procesa temeljenu na DOE-za uspostavljanje prostora dizajna procesa s dovoljnom tolerancijom. Intervalna-kontrola parametara može kompenzirati varijabilnost proizvodnje. Nakon što se otkrije protein u permeatu, jednostavan sustav UV detekcije može dati početno upozorenje, nakon čega slijedi elektroforeza, HPSEC i ELISA radi sljedivosti i identifikacije. To omogućuje točnu razliku između ciljnog proizvoda i nečistoća-stanica domaćina, omogućujući ciljano istraživanje korijenskih-uzroka i korektivne radnje. Ovo je također standardizirana istraživačka komponenta trenutno uključena u CMC dokumentaciju za mAb projekte.
