Tehnologija inaktivacije i uklanjanja virusa iz krvnih pripravaka

Krvni produkti su "komponente proteina plazme ili komponente krvnih stanica, kao što su albumin ljudske krvi, ljudski imunoglobulin, koncentrat crvenih krvnih zrnaca (prirodnog ili rekombinantnog) ljudskog faktora zgrušavanja itd., odvojeni od zdrave ljudske plazme ili specifično imune ljudske plazme, pročišćeni ili izrađen tehnologijom rekombinantne DNA, za dijagnostiku, terapiju ili pasivnu imunoprofilaksu”. Krvni pripravci imaju važnu ulogu u hitnoj medicinskoj pomoći, spašavanju ozlijeđenih u ratu te prevenciji i liječenju nekih specifičnih bolesti.

 

Regulatorna pozadina

Prakse osiguranja sigurnosti moraju osigurati da je konačni lijek siguran za regulatore i, u konačnici, za pacijente i javnost. U 1990-ima, Međunarodna koordinacijska konferencija (ICH 1998.) izdala je "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or animal Origin Cell lines" (Q5A: Viral Safety Assessment), uspostavljajući svjetski standard za virusnu sigurnost.

ICH Q5A opisuje višeslojnu shemu za testiranje i provjeru valjanosti za postizanje ovog cilja. Program testiranja usredotočen je na banku stanica, sirovine i sakupljanje bioreaktora, nadopunjeno analizom rizika proizvoda. Osim testiranja, ICH Q5A zahtijeva da se nizvodna dekontaminacija ocijeni kao sigurna mjera kada se uzvodno ne otkriju nikakvi kontaminanti. Provjera odobrenja osigurava da se virus, ako izbjegne režim testiranja, može ukloniti i/ili deaktivirati prije nego što završi u konačnom lijeku.

 

Pozadina cjelokupnog programa zaštite od virusa

U modernoj biotehnološkoj proizvodnji (ili bioprocesu) obično postoje tri ili četiri jedinične operacije u cijelom pročišćenom nizu, koje mogu ukloniti ili deaktivirati virus. To uključuje određene kromatografske korake (kao što je protein A ili anionska izmjena), kulturu niskog pH ili deterdžente i filtre za zadržavanje virusa. Neće svi ovi koraci učinkovito ukloniti ili deaktivirati sve viruse.

Na primjer, kultura s niskim pH obično je neučinkovita za inaktivaciju virusa bez ovojnice, ali dobro funkcionira za inaktivaciju virusa s ovojnicom. Pod određenim radnim uvjetima kolona za anionsku izmjenu možda neće moći vezati i ukloniti neutralne izoelektrične viruse iz struje proizvoda, ali je učinkovita protiv kiselih virusa.

To je kombinacija tri do četiri neovisne i ortogonalne operacije jedinica koje zajedno osiguravaju sigurnost biotehnoloških proizvoda od virusa.

 

Općenito se pretpostavlja da će robustan, učinkovit i pouzdan korak obrade moći ukloniti ili deaktivirati veliki broj virusa (obično se definira kao 4 log10 ili više, gdje se vrijednost smanjenja log ili LRV izračunava kao log10 ukupnog broja virusa broj virusa na ulazu podijeljen s ukupnim brojem virusa na izlazu). Međutim, LRV se ne može koristiti kao jedinstvena apsolutna mjera učinkovitosti koraka. Podaci mogu biti preliminarni. Lako ga je modelirati, relativno je neosjetljiv na promjene u uvjetima procesa i učinkovit je protiv niza virusa (WHO 2004).

Virusna filtracija široko je prepoznata kao snažan i učinkovit procesni korak i ključna je komponenta cjelokupne strategije za smanjenje rizika od egzogenih i endogenih virusnih čestica tijekom proizvodnje biotehnoloških proizvoda.

Virusni filtri često rade kroz snažne mehanizme zadržavanja temeljene na veličini. Na temelju ovog snažnog mehanizma djelovanja, vjerojatnije je da će virusni filtri od kromatografskih koraka osigurati predvidljivo zadržavanje virusa za niz virusa. To je zato što je manja vjerojatnost da će na filtar utjecati razlike u fizikalno-kemijskim svojstvima različitih virusa i interakcije virus-smola regulirane radnim uvjetima. Stoga se korak virusne filtracije obično koristi u dobro osmišljenim procesima pročišćavanja rekombinantnih terapeutskih proteina (EMEA 1996), za koje se također pokazalo da imaju snažne performanse u industriji obrade plazme.

 

Međutim, krvni pripravci su poput dvosjeklog mača, koji ne samo da spašava tisuće života, već također ima mogućnost širenja bolesti i predstavlja prijetnju ljudskom zdravlju. Prema statistikama, od 1977. do 1984. najmanje 30000 primatelja krvi u Sjedinjenim Državama primilo je krv zaraženu virusom AIDS-a. Godine 1985. 1200 od 3 000 hemofiličara u Francuskoj bilo je zaraženo AIDS-om putem transfuzije krvi ili krvnih produkata.

Prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji, 5% do 10% infekcija AIDS-om diljem svijeta uzrokovano je transfuzijom krvi ili krvnih produkata zaraženih AIDS-om. Prvi slučaj AIDS-a u Kini zaražen je korištenjem uvezenih krvnih pripravaka zaraženih virusom AIDS-a. Osim toga, zabilježen je i prijenos bolesti hepatitisa B i C transfuzijom krvi i krvnih pripravaka.

 

1. Glavni virusi koji se prenose krvnim pripravcima i njihove karakteristike

Postoje mnoge vrste virusa koji se prenose krvlju i krvnim pripravcima, kao što je prikazano u tablici 1. Među njima su HIV, HBV i HCV zabrinuti u domaćim i stranim medicinskim krugovima zbog njihove visoke stope zaraze i ozbiljne štete.

Budući da krv i krvni pripravci imaju mogućnost širenja virusa, to je ozbiljno utjecalo na njegovu primjenu u prevenciji i liječenju bolesti. Stoga se u proizvodnji krvnih proizvoda moraju dodati procesi deaktivacije i uklanjanja virusa kako bi se osigurala sigurnost krvnih proizvoda.

2. Glavne metode inaktivacije i uklanjanja virusa

Kako bi se osigurala sigurnost krvnih pripravaka, osim odabira darivatelja krvi, imunizacije gdje je to moguće, te strogih testiranja prikupljene krvi i drugih mjera, deaktivacija i uklanjanje virusnih tretmana krvnih pripravaka važna je karika u osiguravanju sigurnost transfuzije krvi. U nastavku je detaljno opisano nekoliko često korištenih i učinkovitih metoda za deaktiviranje i uklanjanje virusa.

 

I. Metode inaktivacije virusa

1. Pasteurova metoda

Teorijska osnova ove metode je da je brzina razaranja strukture virusa puno veća od one strukture proteina odabirom temperature i vremena djelovanja. Rezultati gotovo 50 godina kliničke uporabe i nedavni pokusi na životinjama potvrdili su da albumin u otopini nakon tretmana grijanjem od 60 stupnjeva, 10 sati, odnosno Pasteurovom dezinfekcijom, može ne samo inaktivirati HBV, već i inaktivirati HCV i HIV, čineći albumin najpouzdanijim krvni proizvod u virusnoj sigurnosti.

Nedavno je Pasteurov proces proširen na proizvodnju IVIG, FVI, FIX, fibrinogena i drugih proizvoda. Bridonnccu i sur. dodao je ovaj proces inaktivacije virusa procesu proizvodnje etanola pri niskoj temperaturi IVIG, odnosno Pasteur metoda je provedena u uvjetima bez stabilizatora, niske soli i kiselosti, a titar virusa smanjen je za 5 Log. Simmonds i sur. ispitao virus koji se prenosi transfuzijom (TTV) koncentriranih pripravaka FVⅢ i FIX koji se klinički koriste u Ujedinjenom Kraljevstvu i otkrio da je stopa otkrivanja TTV proizvoda bez inaktivacije Pasteurovog virusa 50% do 75%, a pozitivna stopa otkrivanja proizvoda nakon Pasteurove inaktivacije bio je 0.

Pozitivna stopa TTV bila je 27% u 84 bolesnika s hemofilijom u Ujedinjenom Kraljevstvu koji su koristili proizvode s neinaktiviranim faktorom zgrušavanja, dok je samo 1 od 19 pacijenata koji su koristili proizvode s faktorom zgrušavanja inaktiviranim virusom bio pozitivan, s pozitivnom stopom otkrivanja od 5%. Stoga je proces deaktivacije virusa vrlo učinkovit u poboljšanju sigurnosti krvnih proizvoda.

 

2. Organsko otapalo u kombinaciji s surfaktantom (S/D metoda)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Velik broj krvnih pripravaka inaktiviranih S/D metodom dugotrajnom kliničkom primjenom pokazao se sigurnim i pouzdanim, pa su u širokoj primjeni. Međutim, ova metoda nema inaktivacijsku sposobnost protiv parvovirusa B19, HEV-a i drugih virusa koji nisu obloženi lipom.

 

3. Metoda inaktivacije suhom toplinom

Inaktivacija suhom toplinom znači da se liofilizirani pripravak tretira zagrijavanjem i virus se ubija suhom toplinom. Uobičajeno korištene metode suhe topline su 60 stupnjeva ~80 stupnjeva, 10~72 h metoda grijanja i 80 stupnjeva, 72 h metoda liječenja. Još ranih 1980-ih bilo je korisno zagrijavati FVIII liofilizirani koncentrirani pripravak i protrombinski kompleks na 60 ~ 80 stupnjeva 10 ~ 72 h. Međutim, dokazano je da ova metoda ne može potpuno inaktivirati HBV, HCV, HIV. Tretman suhom toplinom na 80 stupnjeva i 72 sata pokazao se učinkovitim u inaktivaciji HBV, HCV i HIV-a. Bilo je i nedavnih izvješća o liofiliziranim pripravcima koagulacijskih faktora tretiranih na 100 stupnjeva. Xu Jinbo i suradnici tretirali su IgG na 100 stupnjeva 30 minuta i inaktivirali virus vezikularnog stomatitisa 8.2 Log. Neki ljudi će zamrzavati sušeni FVIII na 68 stupnjeva 72 sata, u suhom stanju i zatim zagrijavati na 100 stupnjeva 0,5 ~ 1 sat. Ova metoda je relativno ekonomična.

 

4. Fotokemijska metoda

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Zapis stanica vezanih za HIV, a trombociti su ostali dobri nakon 7 dana funkcionalnog očuvanja in vitro, što je FDA odobrila za klinička ispitivanja.

Među tim metodama, Pasteur metoda dezinfekcije i S/D metoda su odobrene od strane FDA Sjedinjenih Država i naširoko se koriste u svijetu. Metoda inaktivacije suhom toplinom uglavnom je prikladna za inaktivaciju virusa liofiliziranih pripravaka. Fotokemijska metoda ima snažan inaktivacijski učinak na viruse obložene lipidima, te se koristi za inaktivaciju virusa u cijeloj plazmi u Europi, te ima široke izglede za inaktivaciju virusa u komponentama krvnih stanica. Međutim, sve ove metode imaju svoje nedostatke, kao što je Pasteurova sterilizacija nije idealna za inaktivaciju nekih virusa otpornih na toplinu; S/D metoda nije mogla učinkovito inaktivirati neobloženi virus. Fotokemijska metoda značajno je oštetila aktivnost nekih proteina plazme. Trenutna klinička uporaba naknadnih istraživanja pokazuje da nijedna metoda deaktivacije virusa ne može jamčiti da su krvni proizvodi potpuno slobodni od rizika prijenosa virusa.

 

I. Proces uklanjanja virusa

U proizvodnji krvnih proizvoda, jedan proces inaktivacije ne može inaktivirati sve viruse; Osim toga, sam virus je heterologni protein, kao što je unos s proizvodom će proizvesti nuspojave; U isto vrijeme, zbog ograničenja tehničke razine, još uvijek postoje virusi čije karakteristike nisu pronađene ili shvaćene, tako da postojeće metode deaktivacije virusa ne mogu jamčiti inaktivacijski učinak ovih virusa. Stoga samo deaktiviranje ne može jamčiti sigurnost proizvoda i mora se ukloniti s proizvoda. Stoga tehnologija uklanjanja virusa dobiva sve više pažnje. Dolje su ukratko opisana dva često korištena i učinkovita procesa uklanjanja virusa.

1. Kromatografska tehnologija

Kromatografska tehnologija odnosi se na korištenje različitih komponenti i razlika u afinitetu stacionarne faze ili međudjelovanja, kako bi se postiglo odvajanje različitih komponenti. Kao napredna tehnologija za proizvodnju krvnih pripravaka, sama kromatografija ima učinak uklanjanja virusa, posebice afinitetna kromatografija i kromatografija ionske izmjene. Za kromatografiju ionske izmjene, elucija ima prednosti u odnosu na penetraciju u uklanjanju virusa. Tablica 2 prikazuje statističke podatke o stopi uklanjanja HAV-a kromatografskom tehnologijom u procesu proizvodnje albumina tvrtke CSL u Australiji. Kao što se može vidjeti iz tablice 2, kromatografija ionske izmjene i gel filtracija učinkovitije su u uklanjanju HAV-a, s ukupnom stopom uklanjanja od 10,9 Log.

U proizvodnji FVIII, Baxter Healtheare provodi imunoafinitetnu kromatografiju koristeći gelove tretirane anti-FVIII antitijelima, koji mogu ukloniti (4,2±0.1)Log i (5,3±0.9)Log iz ne - viruse obložene lipidima kao što su PPV i HAV.

 

2. Filtracija nanofilmom

Za neke viruse s malim promjerom površine, kao što su HAV i parvovirus B19, nanomembranska filtracija je najučinkovitija metoda uklanjanja. Iskorištava razliku u veličini između proteina i virusa i adsorpciju virusa na membranu filtera za izolaciju virusa. Laboratorijska studija provedena je na Sanquin Blood Supply Site u Nizozemskoj o uklanjanju virusa dodavanjem jednostupanjske dvostupanjske nanomembranske filtracije Planova 15N procesu proizvodnje protrombinskog kompleksa. Utvrđeno je da su stope uklanjanja HIV-a, HAV-a i drugih virusa povećane u različitim stupnjevima nakon nanomembranske filtracije (vidi tablicu 3).

Međutim, mogu se pojaviti sljedeći problemi kada se ova metoda primjenjuje u industrijskoj proizvodnji: Prvo, zbog visoke viskoznosti proizvoda i prisutnosti proteina velikog promjera, veličina pora membrane odabrane filtrom ne smije biti premala, čime se ograničava uklanjanje virusa malog promjera kao što je HCV; Drugo, stabilnost kontrole veličine pora membrane u procesu proizvodnje filtera utjecat će na uklanjanje virusa. Treće, kada je otvor membrane manji od promjera čestice virusa blokiran, brzina protoka proizvoda će se smanjiti, što utječe na prinos. Stoga je odabir membrana čija svojstva i veličina pora odgovaraju potrebama prerađenih proizvoda važan čimbenik u tome može li nanomembranska filtracija ukloniti viruse.

 

3. Rasprava

Pod premisom osiguranja kvalitete izvora krvi, proces deaktivacije i uklanjanja virusa važno je i neophodno sredstvo za osiguranje sigurnosti krvnih proizvoda. Korištenje samo jednog postupka s inaktiviranim virusom ne može apsolutno jamčiti sigurnost krvnih proizvoda. Na temelju tehnologije inaktivacije virusa dodana je tehnologija uklanjanja virusa kao što je kromatografija i filtracija nanofilmom, stopa uklanjanja virusa je znatno povećana, a učinak inaktivacije i uklanjanja virusa značajno je poboljšan. Trenutno je Europa jasno predložila da se u procesu proizvodnje krvnih proizvoda mora koristiti barem jedna inaktivacija i uklanjanje virusa kako bi se osigurala sigurnost krvnih proizvoda.

U Kini većina proizvođača krvnih produkata koristi samo jedan proces inaktiviranog virusa u proizvodnom procesu, kao što je Pasteur metoda dezinfekcije, S/D metoda itd., ali ne koriste postupak uklanjanja virusa, što ozbiljno utječe na kvalitetu krvnih produkata. Ulaskom Kine u WTO, proizvodni proces i standardi kvalitete domaćih krvnih pripravaka bit će u skladu sa svjetskim, inače ne može jamčiti postojeći domaći tržišni udio, ali također ne može konkurirati sličnim proizvodima u drugim zemljama u međunarodno tržište.

Stoga kineski proizvođači krvnih proizvoda moraju poboljšati proizvodni proces, ojačati inaktivaciju i uklanjanje virusa, kako bi u potpunosti osigurali kvalitetu i sigurnost proizvoda. Stoga će kineski proizvođači krvnih proizvoda biti trend da koriste kromatografiju za pročišćavanje krvnih proizvoda i uklanjanje virusa kako bi osigurali sigurnost krvnih proizvoda.

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko poduzeće koje se fokusira na biofarmaceutike, kulturu stanica, pročišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnozu i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filtarske uređaje, kazete za ultrafiltraciju i mikrofiltraciju, filtar za viruse, TFF sustav, dubinski filtar, šuplja vlakna itd. koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutike, stanične kulture itd. Naše membrane i membranski filtri naširoko se koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do proizvodnih filtracijskih sustava, ispitivanja sterilnosti, fermentacije, kulture stanica i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology veseli se suradnji s vama!