Primjena ultrafiltracije u proizvodnji ljudskog cjepiva protiv bjesnoće

Kako bi se promicala primjena ultrafiltracije u proizvodnji ljudskog cjepiva protiv bjesnoće, korištena je kazeta ultrafiltracijske membrane od 300 kDa za koncentriranje otopine žetve virusa bjesnoće i detektiranje oporavka antigena, brzine uklanjanja endotoksina i brzine uklanjanja proteina domaćina nakon ultrafiltracije. Rezultati su pokazali da je pod odgovarajućim pritiskom otopina žetve virusa bjesnoće bila koncentrirana 80 puta, eluirana 25 puta, stopa oporavka antigena bila je 86.2%, stopa uklanjanja bakterijskog endotoksina bila je 87,5% ~ 88,7%, i stopa uklanjanja proteina domaćina bila je 91,6%.

 

Predgovor

 

Bjesnoća je tradicionalna, drevna zoonotska bolest uzrokovana virusom bjesnoće (RV), sa stopom smrtnosti do 100%. Trenutačno ne postoji učinkovit tretman za postizlaganje (tj. oštećenje kože i sluznice) osim hitnog cjepiva i cijepljenja imunoglobulinom. Glavni izvor bjesnoće kod ljudi su ugrizi bolesnih ili potencijalno zaraženih životinja (uglavnom pasa). Po stopi smrtnosti od bjesnoće Kina je na drugom mjestu u svijetu, a bjesnoća je jedan od problema koji prijeti javnozdravstvenoj sigurnosti u našoj zemlji. Kapsularni glikoprotein virusa bjesnoće, koji je jedini ključni antigen koji inducira proizvodnju zaštitnih neutralizirajućih protutijela, bio je u središtu istraživanja i razvoja novih cjepiva i novih tehnologija za dijagnosticiranje i liječenje virusa bjesnoće.

 

Virus bjesnoće pripada rodu virusa bjesnoće iz obitelji rabdovirusa. Oblik nukleokapsida je elastičan, nukleokapsid je spiralno simetričan, a površina ima ovojnicu u kojoj se nalazi jednolančana RNK. To je patogen koji uzrokuje bjesnoću. Virus bjesnoće ima dva glavna antigena: jedan je glikoproteinski antigen na vanjskoj membrani virusa, koji se može vezati na receptor acetilkolina i učiniti virus neurotoksičnim, te proizvesti neutralizirajuća antitijela i antitijela koja inhibiraju hemaglutinaciju u tijelu, a neutralizirajuća antitijela imaju zaštitni učinak; Drugi je unutarnji riboproteinski antigen, koji može natjerati tijelo da proizvodi antitijela koja vežu komplement i precipitin, a nema zaštitni učinak.

 

Endotoksin je vrsta lipopolisaharidne tvari (LPS), koja ima toplinsku otpornost i kemijsku stabilnost i nije ju lako uništiti. Ako postoji određena koncentracija endotoksina u cjepivu, to će izazvati jaku temperaturu, pa čak i smrt nakon cijepljenja, stoga sadržaj endotoksina u cjepivu treba smanjiti što je više moguće. Izdanje Kineske farmakopeje iz 2005. (Dio III) odredilo je da kontrolna vrijednost kvalificiranog indeksa endotoksina cjepiva protiv bjesnoće ne smije biti veća od 100EU/dozi. S brzim razvojem tehnologije membranske separacije, primjena tehnologije ultrafiltracijske membranske separacije za smanjenje sadržaja endotoksina u cjepivima postaje sve raširenija u farmaceutskoj industriji.

 

Cjepivo protiv bjesnoće je cjepivo protiv bjesnoće. Obično postoje tri vrste cjepiva protiv bjesnoće, uključujući pročišćeno cjepivo Vero stanica, cjepivo s ljudskim diploidnim stanicama i cjepivo iz primarne stanične kulture. Cjepivo protiv bjesnoće izrađuje se inokulacijom fiksnog virusa virusa bjesnoće u stanični matriks, nakon uzgoja, žetve, koncentracije, inaktivacije, pročišćavanja i dodavanja odgovarajućeg stabilizatora. Glavna funkcija cjepiva protiv bjesnoće je potaknuti tijelo na brzi imunološki odgovor i proizvodnju zaštitnih protutijela protiv virusa bjesnoće, kako bi se spriječila infekcija uzrokovana virusom i smanjio rizik od bolesti.

 

 

Proces proizvodnje cjepiva ima važnu ulogu u osiguravanju kvalitete cjepiva, a posebno je važnija kvantifikacija nekih pokazatelja u procesu proizvodnje. U procesu proizvodnje ljudskog cjepiva protiv bjesnoće, tehnologija ultrafiltracijske koncentracije je neophodno sredstvo za proizvodnju ljudskog cjepiva protiv bjesnoće. Korištenje ultrafiltracijske membrane razumnog otvora za ultrafiltracijsku koncentraciju može učinkovito ukloniti endotoksin i protein domaćina, te zadržati RV antigen, što je pogodno za proizvodnju cjepiva i poboljšanje kvalitete. Relativna molekularna masa RV molekula je 350kDa ~ 460kDa, a teoretski, RV se može potpuno uhvatiti ultrafiltracijskom koncentracijom pomoću membranske kazete s molekularnom težinom presretanja od 100kDa i 300kDa. Endotoksin često formira strukturu agregata u različitim vodenim otopinama, jer je zbog stupnja agregacije veličina molekule različita. Relativna molekularna masa monomera endotoksina je 10kDa ~ 20kDa, a relativna molekularna masa njegovog polimerizacijskog oblika je 300kDa ~ 1000kDa ili više od 1000kDa. Na temelju razlike u molekularnoj težini, RV antigen u ljudskom cjepivu protiv bjesnoće je zadržan, a endotoksin i protein domaćina u ljudskom cjepivu protiv bjesnoće uklonjeni su ultrafiltracijskom membranom od 300 kDa.

 

U ovom eksperimentu, ultrafiltracijska membranska kazeta s otvorom od 300kDa i površinom membrane od 0,11 m2 korištena je kao tretman malog uzorka za koncentriranje međuproizvoda ljudskog cjepiva protiv bjesnoće, te protok membrane, učinkovitost tretmana, višestruka koncentracija, presretanje antigena, uklanjanje endotoksina , i testirano je uklanjanje proteina domaćina.

 

2Metoda materijala

 

2.1 Eksperimentalni materijali

Virus bjesnoće fiksni virus CTN-IV soj; Vero stanice; 0.5M natrijev hidroksid; 300kDa ultrafiltracijska membranska kazeta (PES materijal, površina membrane 0,11 m²).

 

2.2 Eksperimentalne metode

2.2.1 Priprema otopine za sakupljanje virusa

Smrznute Vero stanice reanimirane su u toploj vodi na 37 stupnjeva ~ 39 stupnjeva, stanična suspenzija je iscijeđena, a zatim dodana u 199 medij kulture koji sadrži 10% inaktiviranog telećeg seruma. Uniformne jednoslojne stanice uzgajane su na 37 stupnjeva. Soj CTN-IV inokuliran je virusom bjesnoće u omjeru 0.1mol/L i uzgajan na 37 stupnjeva. Nakon 48 sati, medij za kulturu je odbačen i dodan je 199 medij za kulturu koji je sadržavao 0,1% albumina iz ljudske krvi kako bi se kultura održala na 33° ~ 35°. Sakupite otrov bolesti jednom svaka 3d-5d i kombinirajte više tekućina za žetvu.

 

2.2.2 Ugradnja membranske kasete

Ugradite membransku kasetu i spojite ožičenje kao što je prikazano na donjoj slici.

 

2.2.3 Pranje vodom

Zatvorite ulazni ventil, povratni ventil i prolazni ventil i umetnite povratni kraj i prolaznu krajnju cijev u spremnik otpadne tekućine. Napunite usisni spremnik s 1 L vode za injekcije.

Otvorite ulazni i povratni ventil, zatvorite prolazne ventile, otvorite pumpu, očistite povratni vod s 10% volumena pročišćene vode ili vode za injekcije i održavajte ulazni tlak na 0,35 bara (5 psi).

Otvorite ventil filtera, zatvorite povratni ventil i upotrijebite preostalu vodu za ubrizgavanje za čišćenje cijevi filtera, održavajući TMP na 0,35 bara.

 

2.2.4 Dezinfekcija

Zatvorite ulazni ventil, povratni ventil i prijenosni ventil te umetnite povratni kraj i krajnje vodove prijenosa u spremnik otpadne tekućine. Napunite usisni spremnik s 2L otopine za čišćenje.

Otvorite ulazni i povratni ventil, zatvorite prolazne ventile, otvorite pumpu, očistite povratni vod s 200mL 0,5 M natrijevog hidroksida i održavajte ulazni tlak na 0,35 bara (5 psi) .

Otvorite prolazni ventil, zatvorite povratni ventil i očistite prolaznu cijev s 200mL volumena otopine za čišćenje, održavajući TMP na 0,35 bara.

Zatim se povratni kraj i prolazna cijev umetnu u spremnik za tekućinu radi cikličkog čišćenja. Ciklus čišćenja s 1 ~ 1,5 puta tangencijalnom brzinom protoka procesa tijekom 30 minuta.

Ocijedite 0.5 M natrijevog hidroksida i isperite vodom za injekcije u skladu s 2.2.4 do neutralne reakcije.

 

2.2.5 Ispitivanje protoka vode

Dodajte pročišćenu vodu u usisni spremnik, izmjerite i zabilježite temperaturu vode u usisnom spremniku. Umetnite povratni kraj u spremnik. Pokrenite pumpu i prilagodite brzinu pumpe i povratni ventil da postignete transmembransku razliku tlaka od 0.35 bara (5 psi). Pomoću cilindra izmjerite i zabilježite brzinu protoka na kraju u ml/min. Podesite brzinu pumpe i povratni ventil da dobijete 1 bar (15 psi) transmembranskog diferencijalnog tlaka. Pomoću cilindra izmjerite i zabilježite brzinu protoka na kraju u ml/min.

Kako biste standardizirali vrijednost protoka vode, podijelite izračunatu vrijednost protoka vode s transmembranskom razlikom tlaka i pomnožite faktor korekcije temperature u sljedećoj tablici.

 

2.2.6 Ultrafiltracijska koncentracija

Isperite vodu iz sustava vrhom međuspremnika. Ciklusirajte 5 minuta kako biste prilagodili pH i ionsku stabilnost sustava. Ako je potrebno prilagoditi temperaturu, nastavite s ciklusom dok se temperatura sustava ne stabilizira.

Dodajte tekućinu za napajanje u usisni spremnik, postavite brzinu protoka za napajanje (npr. 400LMH) i testirajte brzinu protoka pri različitim vrijednostima TMP. Prema podacima ispitivanja, krivulje su nacrtane s TMP kao apscisom i Fluxom kao ordinatom.

Usmjerite prolaznu cijev u odgovarajući spremnik ili odvod, kao što su prolazni spremnici za prikupljanje, spremnici otpadne tekućine i procesni odvodi.

Zabilježite početnu težinu napojne tekućine u napojnom spremniku, pokrenite napojnu pumpu i polako cirkulirajte napojnu tekućinu 3 do 4 minute. Recirkulacija može pomoći u uklanjanju zaostalog zraka na putu protoka, čime se povećava učinkovitost filma.

Otvorite prolazni ventil, polako povećavajte brzinu pumpe dok se ne postigne optimalna tangencijalna brzina protoka i podesite povratni ventil kako biste postigli optimalni TMP sustava.

Zatim stavite cijev u spremnik za prikupljanje, počnite mjeriti vrijeme kada tekućina uđe u spremnik i zabilježite ulazni i povratni tlak u odgovarajućim intervalima i zabilježite kvalitetu tekućine tijekom vremena na kraju povrata i kraju kako biste izračunali trenutni protok.

Ultrafiltracijska koncentracija uzorka je dovršena kada se tekući volumen hrane smanji na ciljni volumen koncentracije.

 

2.2.7 Dijaliza

Stavite usisnu cijev, cijev za dopunjavanje i povratnu cijev u usisni spremnik, stavite prijenosnu cijev u spremnik za prikupljanje i stavite spremnik za prikupljanje na vagu da se očisti.

Otvorite povratni ventil, pokrenite ulaznu pumpu, otvorite prolazni ventil, podesite brzinu pumpe i TMP na odgovarajuću vrijednost. Otvorite pumpu za nadopunjavanje, zadržite volumen tekućine u usisnom spremniku nepromijenjenim i započnite dijalizu jednakog volumena. Započnite mjerenje vremena kada tekućina uđe u spremnik i zabilježite tlak na ulaznom kraju, povratnom kraju i masu tekućine u odgovarajućem vremenskom intervalu te izračunajte trenutnu brzinu protoka.

 

2.2.8 CIP

Prvo isperite puferom, zatim isperite vodom za injekcije (operacija 2.2.3), zatim očistite sredstvom za čišćenje (operacija 2.2.4) i na kraju isperite vodom za injekcije (operacija 2.2.3).

 

2.2.9 Ispitivanje protoka vode

Radnja je sljedeća: 2.4.5.

 

2.2.10 Očuvanje membranske kasete

Kratkotrajno skladištenje (Manje od ili jednako 3 dana), držite membransku kazetu u učvršćenju i koristite otopinu za skladištenje za ciklus od 10 do 15 minuta, zatvorite ventil sustava, prekinite napajanje pumpe za tekućinu i osigurajte da je ulazni spremnik tekućine ispravno zabrtvljen.

Ako je vrijeme skladištenja od 3 dana do 1 mjeseca, uklonite membransku kasetu iz uređaja i zatvorite je u plastičnu vrećicu ili drugu hermetički zatvorenu posudu. Dodajte oko 50 mL do 100 mL otopine za pohranjivanje u plastičnu vrećicu ili hermetički zatvorenu posudu i zatvorite je. Ili se može uroniti izravno u otopinu za skladištenje. Sljedeća tablica preporučuje uvjete skladištenja.

 

3 Rezultati i analiza

 

3.1 Ispitivanje čimbenika utjecaja na učinkovitost uklanjanja pirogena

Radni tlak ultrafiltracije: 15 ispitnih serija je kontinuirano izvođeno. U svakoj seriji, tlak filtracije je održavan na 5, 10, 15 i 2{{10}}psi tijekom ultrafiltracije, a tekućina sakupljene virusa koncentrirana je 30 puta i eluirana puferskom tekućinom (10 puta veći volumen) u kontinuiranom protoku. Rezultati kao što su prikazani u tablici ispod, stopa uklanjanja endotoksina bila je manja od 87,0%, stopa oporavka antigena bila je stabilna na 86,0%, a stopa uklanjanja proteina domaćina bila je stabilna na 90,0%, što ukazuje da su različiti radni pritisci imali mali utjecaj na učinak oporavka antigena, uklanjanja endotoksina i uklanjanja proteina domaćina.

Koncentracijski omjer ultrafiltracije: 15 testnih serija je rađeno kontinuirano. U svakoj seriji, tekućina sakupljene virusa koncentrirana je 30 puta, 50 puta, 80 puta odnosno 100 puta tijekom ultrafiltracije. Tlak filtracije je održavan na 20 psi, a tekućina pufera (10 puta veći volumen) je eluirana kontinuiranim protokom. Rezultati prikazani u sljedećoj tablici, stopa uklanjanja endotoksina kretala se od 53,3% do 86,9%, stopa oporavka antigena ostala je stabilna na 86,0%, a stopa uklanjanja proteina domaćina bio stabilan na 91,0%. U segmentiranom uzorkovanju, antigen nije detektiran u otopini za prijenos, a manje od 10% proteina domaćina ostalo je u koncentriranoj otopini virusa. Koncentracija endotoksina u koncentriranoj otopini virusa povećavala se s povećanjem koncentracije puta, a brzina uklanjanja endotoksina bila je najveća u koncentriranom uzorku od 80 puta, a proizvođač je također mogao uzeti u obzir koncentraciju od 100 puta, što ne samo poboljšala učinkovitost proizvodnje i smanjila troškove, ali i zadovoljila zahtjeve proizvodnje cjepiva.

 

3.2 Iscrpljivanje protoka membranske kasete i regeneracija čišćenja

Nakon tretmana, stopa oporavka membranskog protoka bila je 92,6%. Prva stopa oporavka nove membranske kazete je normalna, prema trenutnim promatranim svojstvima napojne tekućine, naknadnom predviđanju drugog i NTH vremena, stopa oporavka protoka membranske kazete bit će blizu podataka nakon ovog tretmana, i imaju tendenciju da budu stabilni. Unutar 2 sata jednokratne upotrebe, pražnjenje membranske kazete bilo je idealno, a samo 10% membranskog protoka bilo je iscrpljeno tijekom cjelokupnog rada.

3.2.1 Smanjenje protoka u procesu obrade membranskih kazeta

3.2.2 Rezultat čišćenja i regeneracije membranske kazete

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko poduzeće koje se fokusira na biofarmaceutike, kulturu stanica, pročišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnozu i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filtarske uređaje, kazete za ultrafiltraciju i mikrofiltraciju, filtar za viruse, TFF sustav, dubinski filtar, šuplja vlakna itd. koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutike, stanične kulture itd. Naše membrane i membranski filtri naširoko se koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do proizvodnih filtracijskih sustava, ispitivanja sterilnosti, fermentacije, kulture stanica i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology veseli se suradnji s vama!