Membranska tehnologija i pojašnjenje cjepiva (Ⅱ)

U prethodnom smo članku imali preliminarni uvod u cjepiva i strategije pojašnjenja cjepiva, a nastavit ćemo ih istraživati ​​u ostatku ovog članka. Nastavno na gore navedeno, nastavit ćemo dijeliti pojašnjenja cjepiva i povezane primjene membranskih tkiva.

 

2.2.2 Utjecaj fizikalnih i kemijskih svojstava virusa

Nakon razmatranja sustava proizvodnje i metoda za uklanjanje relevantnih kontaminanata u koraku bistrenja, važno je uzeti u obzir karakteristike virusa i usredotočiti se na maksimiziranje prinosa virusa.

 

2.2.2.1 Jednostavna apsorpcija virusa
Pozitivno nabijeni materijali i pomoćna sredstva za filtriranje (kao što je dijatomit) razvijeni su za poboljšanje učinaka dubokog filtriranja. Iako pozitivni naboj povećava hvatanje nukleinskih kiselina i HCP-a, poznato je da dijatomit veže stanične ostatke i koloide. Međutim, ti materijali također mogu zadržati virus putem adsorpcijskog mehanizma. Budući da je virus obično negativno nabijen u otopini, može doći do elektrostatskih interakcija s pozitivno nabijenim filtrom.
Virusi se također mogu vezati svojim hidrofobnim ili nespecifičnim interakcijama s određenim filtarskim materijalima (kao što je dijatomit ili staklena vlakna). Virusi s ovojnicom su zbog svoje lipidne ovojnice podložniji ovoj adsorpciji. Ako se virus adsorbira na filtar putem elektrostatskih interakcija, a čestice virusa se odvoje zbog kompeticije soli, ispiranje filtra puferom visoke vodljivosti može djelomično oporaviti virus. Međutim, to također može eluirati kontaminante kao što su HCP ili nukleinske kiseline. Stoga je poželjna uporaba alternativnog filterskog materijala, kao što je inertniji polipropilen.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Dobro je poznato da su virusi influence skloni gubitku adsorpcije tijekom bistrenja. Stoga je upotreba filtra koji se ne naplaćuje, filtra na bazi polipropilena, prikladna za pročišćavanje zbirke gripe. Thompson i suradnici izvijestili su o korištenju polipropilenskog filtra nominalne veličine 1,2 µm nakon kojeg slijedi 0.45 µm PVDF membrana za razjašnjavanje staničnog virusa influence proizvedenog od strane MDCK stanica. Provedeno je ukupno devet testova pročišćavanja na skali od 20L, uz opterećenje od 111 L/m2 za 1,2 μm polipropilenski filtar i 105 L/m2 za 0,45 μm PVDF filtar. Rezultati su pokazali da se većina aktivnih virusa dobro oporavila (78-154%). Također su izvijestili o uklanjanju do 58% hcDNA, ali bez značajnog uklanjanja HCP-a.

 

2.2.2.2 Izrezivanje osjetljivih virusa

Neki virusi (inkapsulirani ili neinkapsulirani) pokazuju nisku mehaničku otpornost i mogu se uništiti izlaganjem smicanju tijekom koraka centrifugiranja i membranske filtracije. Smične sile nastale tijekom koraka pročišćavanja koji uključuju filtraciju ili kromatografiju mogu uzrokovati otpadanje virusne ovojnice, što utječe na infektivnost. Ovisno o veličini, debljini i geometriji kapside, virusna kapsida može biti krta ili, obrnuto, otporna na visoke pritiske. Neki virusi s ovojnicom, kao što su virusi influence, elastični su na mehanička opterećenja i mogu izdržati velike deformacije. S druge strane, posmična sila može uzrokovati da ovojnica manje otpornih virusa, poput retrovirusa, otpadne, što utječe na infektivnost virusa.

VLP-ovi izvanstanične ovojnice također su vrlo ranjivi. Visoke brzine smicanja stvaraju se u centrifugalnom procesu, uglavnom na ulaznom i izlaznom dijelu (visoke brzine smicanja stvaraju se na granici plin-tekućina). Kada je virus pročišćen gradijentnim centrifugiranjem, sposobnost transdukcije nekih retrovirusa bila je značajno oslabljena. Prilikom projektiranja centrifugalnog odvajanja mora se uzeti u obzir relativna nestabilnost virusnih čestica na sile smicanja. Centrifugalna sila nije jedini izvor smičnih šokova, važniji je dizajn opreme, posebno kod uvoza i izvoza također postoji značajan smični šok. Razlike u dizajnu različitih ljestvica mogu dovesti do razlika u prinosu i oporavku virusa osjetljivih na smicanje na različitim ljestvicama.

Viruse osjetljive na smicanje treba pažljivo dizajnirati jer veličina smičnog naprezanja i vrijeme izloženosti naprezanju (zbog recirkulacije) mogu biti visoki. Za viruse osjetljive na smicanje, preferiraju se uređaji otvorenog kruga (uređaji sa šupljim vlaknima ili otvorenim pločama) za smanjenje turbulencije i sila smicanja u dovodnom kanalu.

Odabir radnih parametara također bi trebao minimizirati oštećenje virusnih čestica: nizak poprečni protok, srednji transmembranski tlak (TMP) i kratko vrijeme obrade.

Kontaminacija membrane pod visokim tlakom dovodi do gubitka infektivnosti virusa, vjerojatno zbog sila koje djelovanje smicanja može djelovati na ovojnicu virusa. Membransko odvajanje temelji se na veličini, a nakupljanje virusnih inhibitora velike molekularne težine i virusnih čestica može smanjiti infektivnost virusnih vektora.

Degradacija virusa osjetljivih na smicanje tijekom duboke filtracije nije široko dokumentirana. Gubitak virusa u dubokoj filtraciji najčešće se pripisuje hvatanju, adsorpciji ili virusnoj degradaciji proizvoda ovisnoj o vremenu i temperaturi. Zapravo, iako se u NFF sustavima može pojaviti mehaničko naprezanje, vrijeme izlaganja NFF proizvoda smicanju je vrlo kratko u usporedbi s drugim tehnologijama zbog brzog jednog prolaza koji se doživljava kod NFF proizvoda.

 

2.2.2.3 Presijecanje prema veličini otvora

Virusi preko 100 nm mogu se zadržati uklanjanjem mikoplazme ili sterilnih membrana (0.22 μm i manje). U ovom slučaju posebnu pozornost treba posvetiti odabiru filtera. Za korake mikrofiltracije TFF, poželjne su membrane 0.45 μm ili 0,65 μm za dobre kanale proizvoda. Za NFF filtraciju u više koraka, najgušći sloj je veći ili jednak 0,45 μm. Treba biti oprezan pri odabiru dubinskog filtra, budući da neki uređaji za dubinski filtar mogu sadržavati sloj filma, što može rezultirati gubitkom proizvoda zbog pogona zadržavanja. Agregacija virusa negativno utječe na proizvodnju virusa i povećava zadržavanje virusa zbog veličine virusa.

Prema patentu Andrea i Champluviera, homogenizacija može spriječiti ili ograničiti začepljenje filtera smanjenjem veličine agregata, osiguravajući veći prinos. Homogenizacija je također poboljšala kapacitet filtracije žetve, koji se povećao za 2.{1}} puta.

Previše nečistoća može ometati oporavak virusa. Nečistoće imaju tendenciju začepiti filtar, a začepljene pore membrane mogu rezultirati smanjenim stopama prolaza virusa. U patentu de Vochta i Veenstre spominje se da je izravno bistrenje visoke gustoće stanica Per. Sakupljanje s TFF ({{0}}.65 ili 0.2 μm membranom) rezultiralo je oporavkom virusa bez adenovirusa. Oporavak se može postići selektivnim uklanjanjem taloženja DNA stanice domaćina prije koraka TFF od 0,65 μm. 70% adenovirusa.

 

 

2.3 Studija slučaja: Optimizacija pojašnjenja virusnog cjepiva

Na Međunarodnoj konferenciji o biološkim procesima 2011. Sanofi Pasteur predstavio je racionalan pristup filtrima za probir za razvoj novih razjašnjenih sekvenci za kandidatska virusna cjepiva. Istraživanje ima za cilj prevladati probleme s kojima se suočavaju u optimizaciji procesa kulture stanica i virusa. Izmjene u prethodnom procesu rezultirale su gubitkom prinosa od 20% i preuranjenom kontaminacijom filtra tijekom koraka bistrenja, što nije rezultiralo povećanjem. Kako bi se uspostavio robustan i skalabilan korak bistrenja, bio je potreban potpuni ponovni razvoj sekvence filtera, sa stopama oporavka virusa višim od 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Stopa povrata filtra od estera celuloze i staklenih vlakana ovisi o procjeni filtra (20% ili 90%).

Kao drugi korak, Sanofi Pasteur je procijenio nekoliko kombinacija (sekvence faze 2 ili faze 3) od sedam filtara unaprijed odabranih u studiji probira. Test klasifikacije konstantnog protoka proveden je s malim filtrom. Osim toga, ovaj je eksperiment koristio veći prinos od studije probira. Na temelju rezultata oporavka virusa i kapaciteta filtra, tim je odabrao dvije najbolje kombinacije za daljnje istraživanje.

- Sekvenca 1 (faza 2): 30 μm nominalne nazivne presavijene polipropilenske pretfilter, nakon čega slijedi kompozitni celulozni ester i višeslojni filter od staklenih vlakana (1/0,5 μm poroznost)

- Slijed 2 (stupanj 3): isti predfilter (30 μm nazivni polipropilenski filtar), nakon čega slijedi srednji višeslojni polipropilenski filtar i na kraju asimetrični polieter sulfonski film.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), kao što je prikazano na slici 1.

Slika 1. Prosječni oporavak od virusa pri svakom koraku filtriranja. Studije stabilnosti procijenjene su za tri filtracijske sekvence, od kojih je samo sekvenca 1 korištenjem 30 μm nominalne nazivne presavijene polipropilena i 1.0/0,5 μm celuloznog estera i filtra od staklenih vlakana ispunila globalni cilj oporavka .

Centrifugiranje je također procijenjeno kao primarni korak bistrenja, nakon čega slijedi konačna filtracija {{0}}.45 μm. Ispitano je nekoliko parova brzina/trajanje. Iako je brzina filtracije od 0,45 μm povećana dva puta, konačni prinos bio je niži od ciljanih 85%. Kao rezultat toga, centrifugiranje nije dalje proučavano.

Konačno, izvedba sekvenci filtracije od polipropilena i staklenih vlakana procijenjena je na većoj razini (veličina bioreaktora od 160 L). Redoslijed filtera prikazan je na slici 2.

Slika 2 pojašnjava kombinaciju filtera i grafički prikaz koraka prinosa niza. Niz A je tradicionalni proces, a niz B je optimizirani proces. Optimizirana sekvenca B može smanjiti područje predfiltracije za 3 puta, poništiti srednji korak filtracije i smanjiti konačno područje filtracije za 10 puta, čime se povećava globalni oporavak virusa za 3%.

Nekoliko je serija uspješno pročišćeno bez znakova začepljenja filtera, vrijeme procesa u skladu s ograničenjima proizvodnje i prinos virusa od > 85 posto. Optimizacija koraka bistrenja nije imala utjecaja na daljnje korake i ključne atribute kvalitete cjepiva. Stoga je odabrana sekvenca bistrenja korištena u procesu proizvodnje cjepiva (bioreaktor veličine 1000 L) i učinkovitost je uspješno potvrđena.

 

03 Pojašnjenje bakterijskih cjepiva

3.1 Razmatranja za pojašnjenje bakterijskih cjepiva

Prema Medical Thesaurus (2015), bakterijsko cjepivo definirano je kao suspenzija razrijeđenih ili ubijenih bakterija ili njihovih antigenskih derivata koja se koristi za induciranje imunološkog odgovora za sprječavanje ili liječenje bakterijskih bolesti. Općenitije, bakterijska cjepiva mogu se podijeliti u četiri podkategorije na temelju vrste aktivnog antigena. Ovaj agent može biti:

- Ubija ili slabi sve žive bakterije. Također poznato kao BCG cjepivo.

- Pročišćavanje antigenih determinanti (podjedinična cjepiva). Cjepivo protiv antraksa ili acelularno cjepivo protiv pertusisa.

- Bakterijski toksini (toksoidi). Toksoidi difterije i tetanusa.

- plazmid (pDNA).

Zbog široke heterogenosti proizvoda obitelji, izazovi uzvodnog i nizvodnog procesa uvelike ovise o vrsti cjepiva koje se proizvodi. Stoga se nakon početnog koraka fermentacije može pročistiti ili ne pročistiti, tako da se može izvesti korak bistrenja.

 

3.2 Strategija pojašnjenja bakterijskog cjepiva

3.2.1 Toksoid

Dva najčešća toksoida proizvedena za korištenje cjepiva su difterija i tetanus, koje proizvode Corynebacterium diphtheriae odnosno Clostridium tetani. Proizvodnja obaju cjepiva podliježe strogim zakonskim zahtjevima. Tehničko izvješće WHO-a i njegovi prilozi daju jasne preporuke za osiguranje kvalitete, sigurnosti i učinkovitosti cjepiva protiv tetanusa i difterije. Opća dobra proizvođačka praksa primjenjuje se na proizvodnju oba cjepiva, a zaposlenici moraju biti odgovarajuće obučeni i primiti dodatno cijepljenje protiv obje bolesti.

GMP strogo zahtijeva da se mora dokazati čistoća i kvaliteta konačnog proizvoda. Prema WHO i EP, učinkovitost konačnog cjepiva protiv tetanusa mora se odrediti usporedbom in vivo ili bilo kojom drugom dokazanom metodom s odgovarajućom referentnom tvari kalibriranom u međunarodnim jedinicama prema međunarodnom standardu za toksoid tetanusa. Ažurirani zahtjevi za učinkovitost objavljeni su 2011. i mogu varirati ovisno o metodi procjene. Mora se također dokazati sigurnost (bez toksina i restorativna toksičnost) svake serije cjepiva. Konačno, treba se pozabaviti stabilnošću cjepiva, posebno u stvarnom vremenu.

 

3.2.2 Plazmidno DNA cjepivo

Cjepiva s plazmidnom DNA koriste se u zdravstvene svrhe životinja, a nekoliko cjepiva s plazmidnom DNA za ljudsku upotrebu u različitim je fazama razvoja i kliničke procjene. Nakon fermentacije E. coli, bakterije se skupljaju i cijepaju kako bi se oslobodila plazmidna DNA.

Uklanjanje ostataka stanica obično se postiže centrifugiranjem ili filtracijom. Tema je opširno obrađena u novijim publikacijama. U ovoj publikaciji, trenutni uzvodni, nizvodni i formulacijski procesi i izazovi pDNA.

Autori također daju uvid u nedostatke u svakom koraku tipičnog procesa proizvodnje pDNA i potencijalne buduće inovacije i/ili trenutne tehnološke nedostatke koji bi mogli dovesti do daljnje optimizacije procesa.

Plazmidna DNK cjepiva se pripremaju u dva koraka. Prvo, bakterijske stanice se uklanjaju iz medija kulture, a drugo, stanični ostaci se uklanjaju nakon lize stanica. Ovisno o mjerilu, stanice se prikupljaju centrifugiranjem ili TFF mikrofiltracijom. Centrifuga s diskom se povremeno izbacuje velikom brzinom, a prinos supersmotanih plazmida je slab zbog oštećenja od smicanja tijekom pražnjenja. Ako se mora koristiti centrifugiranje, najbolja je centrifuga s čvrstom zdjelom. Otvoreni kanalni, ravni TFF uređaji s 0.1 ili 0.2 μm mikrofiltracijskim membranama ili uređaji sa šupljim vlaknima mogu dobro raditi.

Budući da uređaji sa šupljim vlaknima imaju veliku nosivost, ponekad im se daje prednost. Ti procesi obično rade na 3-5 puta većoj koncentraciji, nakon čega slijedi 3-5 volumena transfiltracije. Kako bi se smanjilo smicanje i bolje kontrolirala polarizacija membrane, vrlo se preporučuju operacije kontrole penetracije. Iako su centrifuge isplativije u velikim komercijalnim operacijama, procesi manjih razmjera obično koriste filtraciju zbog prenosivosti i jednostavnosti rada.

Flokulanti su korišteni za olakšavanje obrade, ali mogu dovesti do gubitka proizvoda. Neki također preporučuju korištenje čestica inertne dijatomejske zemlje, nakon čega slijedi filtracija u vrećici.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) membranski filtri dobri su za uklanjanje ostataka stanica. Zbog jakog začepljenja staničnih ostataka, preferira se filtracija s malim protokom ili niskim pritiskom. Mikrofilteri na bazi Tff-a korišteni su za ovaj korak i vrećasti filtri industrijske razmjere. Statičko (u posudi za miješanje) i kontinuirano (koristeći linijsku statičku miješalicu) krekiranje zahtijeva različite filtre.

 

3.3 Studija slučaja: Usporedba učinkovitosti centrifugiranja, NFF i TFF metoda za razjašnjavanje toksina tetanusa

Muniandi i sur. usporedio je tri različite metode za pročišćavanje tetanusnih toksina i toksoida iz fermentacijskih tekućina, odnosno centrifugiranje, duboku filtraciju (NFF) i TFF. Ispitni materijal proizveden je u fermentoru od 400L korištenjem modificiranog Millerovog (MMM) medija. U studiji centrifugiranja, stanice su odvojene od srca pri 4000 okretaja u minuti u spremniku 6 × 1L tijekom 60 minuta. Uzorci supernatanta su uzeti kako bi se otkrio oporavak toksoida. Duboka filtracija koristi filtre dubine 0,45 μm i 0,22 μm koji sadrže dijatomejsku zemlju i celulozu za bistrenje fermentacijske juhe. Proces se provodi na temperaturi od 35 stupnjeva i 12psi.

TFF modul otvorenog ravnog panela toplinski je spojen na 0.22μm PVDF membranu u TFF metodi. Proces bistrenja temeljen na TFF-u izveden je pri brzini poprečnog protoka od 2000 L/h na 23 stupnja, a pročišćeni filtrat koncentriran je pri brzini poprečnog protoka od 1000 L/h na 25 stupnjeva korištenjem konvencionalne TFF sendvič 30kD PES membrane. Pročišćena tekućina od mesa (oko 6 L) koncentrira se 10 puta u ovom procesu ultrafiltracije. Testovi toksoida tetanusa provedeni su na koncentriranim uzorcima držača kako bi se procijenio oporavak proizvoda.

Duboka filtracija rezultirala je stopom iskorištenja proizvoda od približno 89%, s TFF jedinicama koje su rezultirale stopom oporabe proizvoda od preko 97%. Postupci mikrofiltracije i ultrafiltracije dosljedno daju veće povrate proizvoda nego NFF proces. Ovi se rezultati temelje na testovima flokulacije (Lf).

 

04Pojašnjenje polisaharidnih cjepiva

4.1 Razmatranje pojašnjenja polisaharidnog cjepiva

Proces proizvodnje nevezanih/slobodnih polisaharidnih cjepiva i povezanih polisaharidnih cjepiva započinje kulturom bakterije domaćina u fermentoru. Na kraju fermentacije bakterije se mogu tretirati sredstvima za čišćenje kao što su DOC (natrijev deoksikolat), Triton®X-100 ili drugim prikladnim reagensima za uništavanje bakterija i poticanje oslobađanja polisaharida. Zbog velikog kapaciteta baterije, prikupljanje izravno putem NFF-a nije ekonomski izvedivo jer protok može biti vrlo nizak. Stoga je idealan izbor korištenje centrifuge za odvajanje staničnih nakupina. Također se može koristiti raspon TFF mikrofiltracije. Središte/penetrant bez stanica koji sadrži polisaharid od interesa dalje se pročišćava NFF sustavom dubinske filtracije, nakon čega slijedi filtracija s biobaterom, a zatim se nastavlja na daljnju obradu za daljnje pročišćavanje.

 

4.2 Strategija pojašnjenja polisaharidnog cjepiva

4.2.1 Prvi postupak pojašnjenja

Centrifugiranje je jedna od najčešćih tehnika za odvajanje stanica od fermentacijskih tekućina. Ovisno o mjerilu, može se odabrati kontinuirano centrifugiranje ili šaržno centrifugiranje. Važno je napomenuti da je pravilna optimizacija uvjeta centrifugiranja i njihovog rada ključna za uspješno pročišćavanje u nastavku. Prilikom odabira specifične TFF membrane i veličine pora, važno je imati na umu molekularnu težinu polisaharida, koji su često veliki i strukturno složeni, s molekularnom težinom u rasponu od približno 500kDa na više od 1000kDa. Zbog velike veličine otvorenih pora, upotreba 0,22 μm, 0,45 μm, 0,65 μm MF membrana može osigurati uspješan oporavak PS molekula u osmotskoj otopini.

 

4.2.2 Sekundarni postupak bistrenja

Bistrina/zamućenost otopine za fermentaciju bez stanica koja dolazi do sekundarnog koraka bistrenja ovisi o specifičnim bakterijama, tipu cijepanja, pojedinačnom tipu seruma i tehnici korištenoj za primarni korak bistrenja. Zamućenost središta može biti u rasponu od oko 50 do 150 NTU. Pozitivno nabijeni duboki filtar frakcijske gustoće izrađen od impregniranog dijatomita s punjenim celuloznim vlaknima može se koristiti za pročišćavanje i smanjenje njegove zamućenosti na < 5NTU.

Volumen protoka ovog dubokog filtra može se kretati od približno 150 L/m3 do 250 L/m3. Obično se pročišćena otopina proizvoda filtrira kroz slijedeću biopoduprtu redukcijsku membranu od 0,45 μm ili steriliziranu membranu od 0,22 μm kako bi se uklonile sve preostale čestice stanica, koloidi i potencijalni mikroorganizmi.

 

4.3 Studija slučaja: Pojašnjenje središta fermentacijske smjese Streptococcus pneumoniae nakon centrifugiranja

Stanice su odvojene dodavanjem {{0}}.1% (v/v) fermentacijske juhe tipa 8 Streptococcus pneumoniae (20 L) kontinuiranim centrifugiranjem. Središte skupljanja filtrira se kroz dva odvojena pozitivno nabijena dubinska filtera od dijatomejske zemlje koji sadrže celulozna vlakna. Filtrat pojedinačnog dubinskog filtra zatim je filtriran kroz PVDF 0,45 μm membranu redukcijskog stupnja biološkog opterećenja. Sva ispitivanja filtracije provedena su u režimu konstantnog protoka s peristaltičkim pumpama. Ispitivanja filtracije korištenjem napunjenog dubokog filtra i fermentacijske juhe Streptococcus pneumoniae serotipa 8 rezultirala su padom zamućenosti s približno 120 NTU na 3 NTU. Ispitivanja su provedena pri brzini protoka od 140,150 L/m2/h i krajnjoj razlici tlaka od 20-25 psi, uz volumenski protok od približno 180-200 L/m2.

Slični testovi filtracije provedeni su na fermentacijskoj juhi Streptococcus pneumoniae serotipa 19A. Centrifugirana tekućina 19A bistri se kroz napunjeni duboki filtar, koji smanjuje zamućenost s oko 40 NTU na 3 NTU. Ispitivanja su provedena pri konstantnoj brzini protoka od oko 140-160 L/ m2 / sat, a volumetrijski protok od 200-230 L/ m2 postignut je pri krajnjem tlaku od oko 15 psid. HLPC analiza uzoraka proizvoda prikupljenih tijekom testova evaluacije filtracije nije pokazala značajan gubitak prinosa za duboku filtraciju ili 0.45 μm (ili 0,22 μm) membrane.

 

05 Zaključak

Razvoj procesa bistrenja zahtijeva integraciju nekoliko jediničnih procesa kao što su centrifugiranje, TFF-MF, duboka filtracija i aseptična filtracija. Optimizacija procesa razjašnjavanja zahtijeva razumijevanje načina na koji različite operacije jedinice utječu jedna na drugu. Izazov je odabrati tehnologije i alate (opremu i opremu) za ispunjavanje sve složenijih zahtjeva procesnih tekućina koje proizvode današnji učinkovitiji bioreaktori. Povećanje uzvodne produktivnosti (titar virusa, gustoća stanica, itd.), stanični ostaci i proizvodi stanične lize povećavaju poteškoće procesa bistrenja i zbunjuju izbor opreme za odvajanje i filtriranje.

Dizajn opreme, jednostavnost korištenja i čistoća trebaju se uzeti u obzir pri odabiru skale procesa. Ovo će osigurati učinkovitu pretvorbu i sigurnost rukovatelja pri radu s odbačenim filtrima. Kako bi se razvio proces bistrenja, važna je snažna integracija koraka bistrenja kako bi se osiguralo da je obrada žetve uzvodno isplativa. Raspon jedinica za filtriranje je lako dostupan kako bi se olakšalo laboratorijsko testiranje, pilot proizvodnja i obrada u punoj veličini. Implementacijom dobro osmišljenog plana rada za proširenje koji procjenjuje višestruke opcije pročišćavanja, može se pouzdano odabrati i odrediti veličinu filtara za pročišćavanje kako bi se zaštitile operacije nizvodne jedinice uz smanjenje operativnih troškova.

Pojašnjenje cjepiva predstavlja nekoliko izazova. Tipično, proces filtracije treba prilagoditi sustavu proizvodnje, agensu za inaktivaciju ili lizu i prezentaciji antigena, a ne nužno cjepivima. Tradicionalni procesi cjepiva obično koriste centrifugiranje za početno bistrenje cjepiva. Moderna cjepiva s višestrukim tehnološkim platformama i manjim obujmom obrade čine cjepiva prikladnijima za bistrenje membranskim tehnologijama. Novorazvijena cjepiva koja koriste moderne stanične linije i ekspresijske sustave i koriste definiranije uvjete kulture stanica čine mnoge procese cjepiva pogodnijima za filtraciju.

 

Međutim, heterogenost u antigenskoj komponenti ili "ciljanom antigenu" proizvoda cjepiva povećava složenost bistrenja filtracijom. Antigeni se razlikuju po veličini, površinskom kemijskom sastavu i naboju. Ove karakteristike utječu na prinos i obnavljanje antigena. Cjepiva predstavljaju jedinstven izazov za pojašnjenje, uglavnom zbog veličine njihovih makromolekula. Ovo, u kombinaciji s problemima sposobnosti oko pojašnjenja, povećava potrebu za smjernicama o strategijama razvoja procesa.

Veličina i opseg komercijalne proizvodnje cjepiva ima značajan utjecaj na izbor tehnologije bistrenja. Budući da se nalazi uzvodno od procesa, odgovarajuća optimizacija bistrenja ključna je za uspjeh nizvodno operacija jedinice, maksimizirajući prinos, oporavak i robusnost procesa. Dok centrifugiranje ostaje održiva tehnička opcija za primarno bistrenje, mikrofiltracijske jedinice otvorenog kanala (TFF) za primarno bistrenje i fini duboki filtri ili membranski filtri za sekundarno bistrenje postaju sve prihvaćeniji u industriji cjepiva. Ova je promjena potaknuta potrebom za bržom obradom, brzim razvojem procesa, prijenosnim procesima i implementacijama za jednokratnu upotrebu. NFF nudi ekonomičan postupak prikladan za male i velike opcije za jednokratnu upotrebu. Zbog promjenjivih regulatornih potreba, dostupnost predaseptičnih uređaja ili modula za gama zračenje dizajniranih za autoklaviranje potiče bržu prilagodbu tehnologija temeljenih na NFF ili TFF.

Mnogi klasični procesi cjepiva uključuju evoluciju operacija jedinica za bistrenje, uglavnom zbog regulatornih ograničenja i povezanih visokih troškova revalidacije i ponovnog podnošenja ili kliničkih ispitivanja. Proces platforme koji koristi shemu bistrenja temeljenu na filtraciji naširoko se koristi u nekoliko bioloških agenasa s visokim stupnjem uspjeha. Primjeri i slučajevi navedeni u ovom dokumentu pokazuju da proizvođači cjepiva imaju potencijal postići ovu razinu stabilnosti, ekonomske održivosti i korisnosti za jednokratnu upotrebu slijedeći pristup šablona.

Druge prednosti filtracije u odnosu na centrifugiranje su virusi osjetljivi na smicanje ili virusi koji imaju tendenciju nakupljanja na zračnom sučelju. Kako proizvođači uređaja budu donosili nove proizvode na tržište, proizvođači cjepiva i dalje će biti bolje opremljeni za proces bistrenja.

 

Kao prva tvrtka u krugu lokalizacije, Guidling Technology je prikupio dovoljno relevantnog iskustva u pojašnjavanju cjepiva. Guidling Technology je tvrtka za razvoj i proizvodnju koja se fokusira na biofarmaceutsku i staničnu kulturu, pročišćavanje i odvajanje. Proizvodi se naširoko koriste u biomedicini, dijagnostici, industrijskoj filtraciji tekućina, detekciji, bistrenju, pročišćavanju i koncentriranju; Guidling je uspješno razvio cijev centrifuge za ultrafiltraciju, membransku kazetu za ultrafiltraciju/mikrofiltraciju, filtar za uklanjanje virusa, uređaj za filtar tangencijalnog protoka, duboki membranski skup itd., koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutike i stanične kulture.

Naše membrane i membranski filtri naširoko se koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naš širok raspon proizvodnih linija, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do proizvodnih filtracijskih sustava, ispitivanja sterilnosti, fermentacije, stanične kulture i više, može zadovoljiti potrebe testiranja i proizvodnje.