Studija procesa bistrenja fermentacijskog lizata visoke gustoće rekombinantne bakterije Escherichia coli

 

Kako bi se smanjio utjecaj materijalne tekućine na kromatografiju i poboljšalo obnavljanje ciljnog proteina, proučavan je proces bistrenja fermentacijskog lizata visoke gustoće dvaju sojeva rekombinantne Escherichie coli. Odabrani su sojevi BL21-HP1036 i BL21-palA koji eksprimiraju ključne gene Streptococcus suis i Haemophilus parasuis. Proces tangencijalnog protoka, proces centrifugiranja velikom brzinom i postupak bistrenja membranske kazete korišteni su za procjenu prinosa proteina pomoću detekcije zamućenosti i elektroforeze.

 

Rezultati su pokazali da je BL21-HP1036, BL21-palA fermentacijski lizat visoke gustoće koji eksprimira ključne gene Streptococcus suis i Haemophilus parasuis pročišćen membranskom kazetnom filtracijom i centrifugiranjem, a prinos proteina bio je preko 80%, što bi moglo učinkovito smanjiti kromatografske smetnje i poboljšati stopu oporavka.

 

Uvod

Trenutačno su Streptococcus suis (SS) i Haemophilus parasuis (HPS) najčešći uzročnici bakterijskih bolesti na farmama svinja, koje donose velike gubitke svinjogojskoj industriji. SS se može podijeliti u ukupno 35 serotipova 1-34 i 1/2, a HPS se može podijeliti u 1-15 serotipova, a ta dva se često miješaju, uglavnom uzrokujući svinjski poliserozitis, artritis, meningitis, endokarditis , bakterijska septikemija i bronhitis.

 

Zbog velikog broja serotipova Streptococcus suis i Haemophilus parasuis, unakrsna zaštita između različitih serotipova je slaba, a otpornost na antibiotike značajno će se povećati pri liječenju antibioticima, što će utjecati na terapijski učinak.

 

Cjepiva su postala jedno od učinkovitih sredstava za prevenciju SS i HPS. Postoje inaktivirana cjepiva, atenuirana cjepiva, živa cjepiva, podjedinična cjepiva i genetski modificirana cjepiva, no na tržištu su uglavnom inaktivirana cjepiva i atenuirana cjepiva, čija je imunološka zaštita dobra, ali unakrsna zaštita nije očita. Subjedinično cjepivo je nova vrsta cjepiva protiv Streptococcus suis, koja je nova vrsta cjepiva sa jakom unakrsnom zaštitom i niskom cijenom. Istraživanje i razvoj podjediničnih cjepiva protiv Streptococcus suis i Haemophilus parasuis pruža savršeno rješenje za probleme prevencije i kontrole Streptococcus suis i Haemophilus parasuis koji muče industriju svinja u Kini.

 

Cjepiva Streptococcus suis i Haemophilus parasuis podjedinice podvrgnuta su fermentaciji visoke gustoće pomoću rekombinantne Escherichie coli. Bistrenje lizata ima velik učinak na prinos ciljnih proteina, ali postoji nekoliko relevantnih izvješća. Važan je posao kako realizirati korak bistrenja fermentacije i procesa pročišćavanja. U ovom radu, rekombinantna E. coli BL21-HP1036, BL21-palA fermentacija visoke gustoće kao objekt, za proučavanje kako učinkovito smanjiti zamućenje otopine za bistrenje, poboljšati prinos proteina, za Proces fermentacije cjepiva podjedinice Streptococcus suis za postizanje tehnologije industrijskog drobljenja i bistrenja za pružanje teorijske osnove i tehničke podrške.

 

1. Materijali i metode

1.1 Materijali

 

1.1.1 Sojevi

Streptococcus suis i Haemophilus parasuis sojevi BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Glavni medij i reagensi

Ekstrakt kvasca i pliskavice; Natrijev klorid; kanamicin, IPTG; Formaldehid iz; SDS-PAGE gel set.

 

1.1.3 Glavna ispitna oprema

Fermentor visoke gustoće; Centrifuga velike brzine; Aparati za elektroforezu; Ultraljubičasti gel sustav za snimanje; Ultrazvučna drobilica; Mala centrifuga velike brzine; Ultraljubičasti spektrofotometar; Stol za mućkanje konstantne temperature; Oprema za afinitetnu kromatografiju.

 

1.2 Metode

 

1.2.1 Kultura fermentacije visoke gustoće

Kvalificirani rekombinantni koliformni sojevi BL21-HP1036 i BL21-pa-lA inokulirani su na sintetski medij pri 2% (V/V) i uzgajani na 37 stupnjeva 35-40 h.

 

1.2.2 Ekspresija inducirana rekombinantnim proteinom

Kada je otopina za fermentaciju OD{{0}}±0.1, indukcija je započela, temperatura indukcije bila je 35 stupnjeva ±0,5 stupnjeva, a kultura je završena nakon 10 sati indukcije.

 

1.2.3 Visokotlačno homogeno drobljenje i centrifugiranje

Tekućina bakterija koja je prošla test inaktivacije usitnjena je visokotlačnim homogenizatorom za pucanje stanica, redom, uz tlak od 100~150 MPa. Nakon drobljenja, usitnjena tekućina je držana na niskoj temperaturi.

Supernatant je dobiven centrifugiranjem velikom brzinom, centrifugalna brzina: 15000 okretaja u minuti, kontrola temperature: 10 stupnjeva ~15 stupnjeva, brzina ubrizgavanja: 0,5~1 L/min, supernatant je sakupljen, a supernatant je napunjen spremnicima koji uklanjaju endotoksin.

 

1.2.4 Bistrenje kazetom s mikrofiltracijskom membranom

Membrana je isprana s 10L pročišćene vode u jednom smjeru i provedena je filtracija tangencijalnim protokom. 300 mL razbijene bakterijske suspenzije nakon centrifugiranja uzeto je iz cjevovodne centrifuge i pročišćeno s 0,45 um kazetom mikrofiltracijske membrane. Zamućenost je mjerena uzorkovanjem, te su uspoređivane zamućenost nakon centrifugiranja, zamućenost pročišćene tekućine u kazeti s mikrofiltracijskom membranom i zamućenost koncentrirane tekućine u kazeti s mikrofiltracijskom membranom. Sadržaj proteina u uzorku detektiran je kromatografijom i elektroforezom kako bi se procijenio prinos proteina.

 

Korak 2: Rezultati

2.1 Podaci o pojašnjenju i rezultati ispitivanja proteina BL21-HP1036 i BL21-palA

Rezultati na Sl. 1 pokazuju da se zamućenost BL21-HP1036 i BL21-palA rekombinantne Escherichia coli tekućine za drobljenje smanjila sa 4 500 NTU i 4 000 NTU na 1970 NTU odnosno 520 NTU, nakon centrifugiranja u epruveti. Zamućenost BL21-HP1036 i BL21-palA rekombinantne Escherichie coli smanjena je na 25 NTU i 1,28 NTU metodom mikrofiltracijske membranske kasete. Može se vidjeti da uporaba mikrofiltracijske membranske kazetne filtracije tangencijalnog protoka i optimiziranog otvorenog kanala protoka ima dobar učinak na smanjenje endotoksina, viskoznosti i zamućenosti kromatografske tekućine od tradicionalne filtracije centrifugom, te može značajno smanjiti razbijeni rekombinantni heteroprotein E. coli i nukleinske kiseline.

 

2.2 Oporavak proteina u uzorcima BL21-HP1036 i BL21-palA

Tablica 1 pokazuje da rekombinantni protein Escherichia coli BL21-HP1036 postoji i u otopini pročišćenoj mikrofiltracijom i u koncentriranom supernatantu prekrivenom membranom za mikrofiltraciju, a ukupni prinos proteina nakon oporavka proteina iz otopine pročišćene mikrofiltracijom i koncentriranog supernatanta iznosi oko 88,5%. Protein BL21-palA također je postojao u pročišćenoj otopini eksudata mikrofiltracije i supernatantu koncentrirane otopine prekrivenom kazetom membrane mikrofiltracije. Ukupni prinos BL21-PALa proteina bio je 81,5%.

 

3. Zaključak

U ovom radu, sojevi koji eksprimiraju ključne gene BL{{0}}HP1036 i BL21-palA Streptococcus suis odnosno Haemophilus parasuis prošli su fermentaciju visoke gustoće i prošli 0,45. Zamućenost tekućine materijala bila je značajno smanjen postupkom um mikrofiltracijske membranske kazete, što ukazuje da je tehnologija filtracije tangencijalnog protoka s mikrofiltracijskom membranskom kazetom bila bolja od one s centrifugom velike brzine i mogla je značajno smanjiti nečistoće proteina i nukleinske kiseline razbijene rekombinantne bakterije Escherichia coli.

 

Nakon skupljanja bistre tekućine u kazeti s jednom mikrofiltracijskom membranom, bilo je 62,9% jer je 37,1% ciljanog proteina BL21-HP1036 bio koncentrat za mikrofiltraciju ili je postojao u kazeti s mikrofiltracijskom membranom i drugi gubici , za pojašnjenje je usvojena metoda u dva koraka. U prvom koraku, kazeta mikrofiltracijske membrane od 0,45 um korištena je za pročišćavanje i skupljanje eksudata; u drugom koraku, preostala koncentrirana tekućina sakupljena je nakon centrifugiranja u epruveti, a pročišćena tekućina u dva koraka kombinirana je kao kromatografski uzorak. Vrijednost zamućenosti tekućine za fermentaciju BL21-palA nije se značajno povećala, prinos proteina mogao je doseći više od 85,5%, a prinos proteina tekućine za fermentaciju BL21-Pala mogao bi doseći 81,5% nakon tretmana u dva koraka.

 

Što se tiče odabira kazete s mikrofiltracijskom membranom, Guidling Technology vam može pružiti visokokvalitetna rješenja. Naši proizvodi serije kazeta s membranom za mikrofiltraciju i kazeta s membranom za ultrafiltraciju koriste polieter sulfon kao nosač, posebno dizajniran za biotehnologiju. Naša polieter sulfonska membrana ima prednosti visoke propusnosti, niske adsorpcije proteina, visoke mehaničke čvrstoće, otpornosti na udarce i tako dalje. Osiguravamo vam posebne membranske stezaljke za mjerenje tlaka na ulazu i izlazu u stvarnom vremenu i možemo osigurati tehničke posjete prema vašim potrebama kako bismo prilagodili vaš poseban sustav ultrafiltracije/mikrofiltracije. Takav mali sustav tangencijalnog protoka može se koristiti za malu, pilotsku i malu proizvodnju, i može biti potpuno linearno pojačan kako bi u potpunosti zadovoljio vaše zahtjeve ispitivanja i zahtjeve proizvodnje.

O Guidlingu

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko poduzeće koje se fokusira na biofarmaceutike, kulturu stanica, pročišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnozu i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filtarske uređaje, kazete za ultrafiltraciju i mikrofiltraciju, filtar za viruse, TFF sustav, dubinski filtar, šuplja vlakna itd. koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutike, stanične kulture itd. Naše membrane i membranski filtri naširoko se koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do proizvodnih filtracijskih sustava, ispitivanja sterilnosti, fermentacije, kulture stanica i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology veseli se suradnji s vama!